تحليلات كفاءة النواقل على بعوض Aedes aegypti باستخدام فيروس زيكا

في حالات التفشي التي تتوسطها الفيروسات المنقولة بالمفصليات (arbovirus)، تقتصر التدابير المضادة إلى حد كبير على مكافحة البعوض. لذا، تُعد تحليلات كفاءة النواقل استراتيجيات وقائية حاسمة لأنها تحدد المجموعات والأنواع من البعوض التي يمكن أن تعمل كنواقل لفيروس معين من الفيروسات المنقولة بالمفصليات، وبالتالي يجب استهدافها. لذا، فإن أحد أهم المكونات في مجموعة أدواتنا لتقييم دور البعوض والنواقل الأخرى في نقل الأمراض المعدية هو دراسة كفاءة النواقل. وهذه عبارة عن تجارب تتيح لنا التحكم بدقة عالية، ليس فقط في نوع البعوض أو القراد على سبيل المثال، بل أيضاً في السلالات الجغرافية، بالإضافة إلى سلالات محددة جداً من فيروس مختلف أو كائن معدٍ آخر، وذلك للحصول على بيانات دقيقة ومنضبطة جيداً حول مخاطر الأنواع المختلفة في نقل عوامل ممرضة متنوعة في مناطق محددة جداً من العالم. ويتطلب العمل مع البعوض المصاب مرافق مخصصة، وتدريباً، وخبرة، وتخطيطاً دقيقاً لتقليل المخاطر التي يتعرض لها الباحث، فضلاً عن مخاطر هروب بعوضة مصابة. لذا، فمن المهم جداً للأفراد الجدد في هذه المرافق تخصيص الوقت للعمل مع بعوض يتغذى على دم غير مصاب لتعريف أنفسهم بالتقنيات وسير العمل.

في يوم التعريض، قم بتشغيل مصدر الطاقة في مرفق احتواء المفصليات لتسخين وحدات التغذية مسبقاً. اخلط دماً بشرياً طازجاً تم حصاده ومضافاً إليه السترات أو الهيبارين مع مخزون فيروسي بنسبة حجمية واحد إلى واحد، ثم غطِّ وحدة خزان قياسية سعتها ثلاثة ملليلتر بجلد فأر سليم غير مصاب. ضع الخزان المغطى على مناشف ورقية بيضاء، وأضف حوالي اثنين من المليلترات من الدم المعدي إلى الخزان، بمعدل مليلتر واحد في كل مرة.

بعد ذلك، افحص باستخدام المناشف الورقية للتأكد من عدم وجود أي تسرب. قبل 24 ساعة من إجراء المقايسة المعدية، قم بتجهيز أطباق زراعة الخلايا ذات الـ 24 بئراً بخلايا Vero، وقم بتمييز كل بئر بهوية البعوضة والعينة. في الصباح الذي سيتم فيه تعريض البعوض لوجبة الدم المعدية، قم بإزالة كرات القطن المشبعة بالماء، وقم بتوصيل خزانات وجبات الدم الاصطناعية بوصلات وحدة التغذية باستخدام صندوق قفازات احتواء بلاستيكي شفاف.

ضع الصندوق الكرتوني الذي يحتوي على البعوض الجائع داخل صندوق القفازات أسفل وحدة التغذية. وعند اكتمال عملية التغذية، قم بإزالة الخزان وغمره في محلول مبيض بتركيز 10% مُحضّر حديثاً. وداخل صندوق القفازات، صب البعوض المخدر البارد في طبق بتري على الثلج، ثم قم بفرز البعوض الممتلئ عن البعوض غير الممتلئ.

صُب البعوض المنتفخ مرة أخرى في الكرتونة الورقية، ثم غطِّها بسرعة بالشبكة والغطاء. قُم بقص الزوائد من شبكة السلك عن الكرتونة، وثبِّت الغطاء بالشريط اللاصق. أضف كرة قطنية مشبعة بـ 10%sucrose معقم ومفلتر إلى الشبكة، وضع الكرتونة في حاوية بلاستيكية ثانوية كبيرة تحتوي على إسفنجة رطبة للحفاظ على الرطوبة.

يتم تحضين الحاوية الثانوية عند 27 درجة Celsius، مع السماح للبعوض بالوصول إلى السكروز حسب الرغبة حتى اكتمال التجارب. استخدم شفاطاً ميكانيكياً للحصول على عدد محدد مسبقاً من البعوض المُحضن من الكرتونة، ثم قم بتغطية أنبوب الجمع بقطعة قطنية دائرية عند الانتهاء. وأثناء العمل داخل صندوق القفازات، صب البعوض المخدر والمبرد في طبق بتري موضوع على الثلج.

قم بإزالة جميع أرجل البعوض الست لكل بعوضة، وضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل مُلصق مسبقاً، يحتوي على محمل كريات من الفولاذ المقاوم للصدأ المعقم و 500 µL من وسط جمع البعوض، أو MCM. ضع البعوضة برفق فوق قطرة من الزيت المعدني، مع الحرص على ألا يلامس الزيت رأس البعوضة أو خرطومها. أدخل الخرطوم في رأس ماصة دقيقة ممتلئ بـ 10 µL من FBS مثبط حرارياً، واترك البعوضة تفرز لعابها لمدة 30 دقيقة.

أفرغ طرف الماصة الذي يحتوي على اللعاب في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 100 µL من MCM، وضع الجثة في أنبوب منفصل سعة 2 مم مع كرة محمل فولاذية معقمة و500 µL من MCM. انقل الأنابيب إلى جهاز تجانس الأنسجة بطحن الخرز داخل كابينة السلامة البيولوجية، وقم بسحق جميع عينات الجسم والأرجل بتردد 26 hertz لمدة خمس دقائق لتحرير الجسيمات الفيروسية في السائل العلوي. قم بتصفية جميع العينات عن طريق الطرد المركزي بقوة 200 ×g لمدة خمس دقائق لترسيب الحطام الخلوي.

قبل التلقيح بالعينات مباشرة، قم بإزالة الأوساط من خلايا Vero التي تم تحضيرها مسبقاً. قم بتوزيع 100 µL من الطافوات المصفاة من الأجسام أو الأرجل بعناية في كل بئر، مع الحرص على عدم تحريك حطام خلايا البعوض من الراسب. بعد ذلك، قم بتحضين الأطباق لمدة ساعة واحدة.

بعد فترة التحضين، أضف مليلتر واحد من طبقة ميثيل السليلوز العلوية إلى كل بئر، ثم أعد الصفائح إلى الحاضنة لمدة تتراوح من ثلاثة إلى سبعة أيام. أخرج صفائح الطبقة العلوية من الحاضنة، وانقلها إلى كابينة السلامة البيولوجية. تخلص من طبقة ميثيل السليلوز العلوية في وعاء يحتوي على مبيض بتركيز 10%، واغسل كل بئر مرتين باستخدام PBS، مع التخلص من كل غسلة في الوعاء.

قم بإزالة الـ PBS، وأضف ملليلتر واحد من الميثانول-أسيتون لكل بئر، واترك الخلايا لتثبت على الطبق لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، تخلص من المثبت، واترك الأطباق لتجف. اغسل كل بئر ثلاث مرات باستخدام PBS غير معقم على هزاز أطباق مداري لمدة 15 دقيقة لكل غسلة، ثم أضف ملليلتر واحد من محلول الحجب إلى كل بئر، وهز الطبق لمدة 15 دقيقة أخرى.

أضف 100 µL من الأجسام المضادة الأولية المضادة لفيروس زيكا (anti-Zika Virus)، أو الأجسام المضادة للفيروسات المصفرة (anti-flavivirus) إلى كل بئر، ثم قم بحضن اللوحة مع الرج طوال الليل. في اليوم التالي، قم بإزالة الأجسام المضادة الأولية، وكرر عمليات الغسل باستخدام PBS. بعد الغسلة الأخيرة، أضف 100 µL من الأجسام المضادة الثانوية، ثم قم بحضن اللوحة مع الرج لمدة ساعة واحدة.

كرر عمليات الغسل باستخدام PBS، ثم أضف 100 microliters من كاشف تطوير الركيزة لكل بئر، ورجّ الطبق لمدة 15 دقيقة. وعندما تتطور البؤر أو اللويحات، أوقف التفاعل عن طريق شطف الطبق بماء الصنبور. صبّ ماء الصنبور، واترك الأطباق لتجف في الهواء، ثم قم بقياس البؤر الفيروسية لتحديد عدد وحدات تكوين البؤر الموجودة في العينة المحددة.

تعرضت ثلاث مجموعات من البعوض لسلالة تفشٍ من فيروس Zika عبر نطاق من عيارات الوجبات الدموية. وخلال الأسبوعين التاليين، تم فحص مجموعات فرعية من البعوض لتحديد معدلات الإصابة والانتشار والقدرة على النقل. وعند عيارات الوجبات الدموية المنخفضة، أصيب البعوض القادم من سالفادور بالبرازيل بالعدوى بعد 4 و10 و14 يوماً من فترة الحضانة الخارجية، مع عدم ملاحظة أي دليل على انتشار العدوى في الأرجل التي تم فحصها.

عند أعلى عيار فيروسي، تم اكتشاف الفيروس في أرجل البعوض، ولكن ليس في اللعاب. وقد ثبت أن البعوض القادم من جمهورية الدومينيكان كان الأكثر عرضة للإصابة، والأكثر كفاءة في النقل عند جميع عيارات وجبات الدم المختبرة. وأظهر البعوض الذي تغذى على الجرعات الثلاث انتشاراً للفيروس بحلول اليوم السابع، وكفاءة في النقل في اليوم الرابع عشر بعد الإصابة.

تعرضت البعوضات من وادي ريو غراندي في تكساس لعيارات منخفضة من وجبات الدم، وأصيبت في وقت مبكر يصل إلى أربعة أيام بعد العدوى، بينما وُجدت إصابات منتشرة بعد 14 يوماً. أما في المجموعة التي تعرضت لأعلى عيار، فقد لوحظت الإصابة بدءاً من اليوم الثاني بعد العدوى، ووصلت إلى ذروتها في الأيام 4 و10 و14. كما لوحظت إصابات منتشرة في اليوم السابع، وكانت بعوضة واحدة فقط قادرة على نقل العدوى في اليوم العاشر.

عند تطبيق هذا البروتوكول، من المهم العمل بأمان بدلاً من السرعة. لذا، يجب دائماً التعامل مع البعوض المصاب أو الذي يحتمل إصابته داخل صندوق القفازات أو خزانة السلامة البيولوجية، إلى أن يتم إزالة أرجلها أو أجنحتها. يمكن تطويع سير عمل كفاءة الناقل الأساسي لإنتاج بعوض مصاب لإجراء تحليلات لاحقة، مثل دراسات الانتقال، وكذلك لفحص التفاعلات بين البعوض والفيروس والميكروبيوم.

لقد كانت الكفاءة الناقلة أداة بالغة الأهمية لفهم دور البعوض في نقل الفيروسات أثناء تفشي الأمراض الفيروسية، وكان هذا الأمر قائماً منذ عدة عقود. ولكنها أيضاً طريقة تطورت على مر السنين لتشمل معلومات جديدة، كلما تعلمناها، حول التفاعلات بين هذه الفيروسات والبعوض الناقل. وعلى سبيل المثال، تبين أن التجمعات الجينية للفيروس، وتعقيد تلك التجمعات داخل البعوض، أمر بالغ الأهمية لقدرته على النقل، وبات بإمكاننا الآن إدراج ذلك في دراسات الكفاءة الناقلة باستخدام طرق جديدة لتسلسل التجمعات الفيروسية.

ونعلم الآن أيضاً أن مجتمعات البكتيريا والكائنات الأخرى التي تعيش في الجهاز الهضمي للبعوض يمكن أن تؤثر بشكل كبير على قدرتها على النقل، ويمكننا أيضاً تقييم تلك المجتمعات الآن باستخدام طرق جديدة في التسلسل الجيني. لذا، فإن كفاءة النواقل هي منهجية تطورت وما تزال تتطور مع تعلمنا المزيد عن هذه التفاعلات المعقدة.