نهج Benchtop لموقع محدد فتح حاجز الدم الدماغ باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة في نموذج الفئران

يمكن أن تركز الموجات فوق الصوتية مع وكلاء microbubble فتح حاجز الدم في الدماغ بشكل مركز وعابر. وقد استخدمت هذه التقنية لتقديم مجموعة واسعة من العوامل عبر حاجز الدم في الدماغ. توفر هذه المقالة بروتوكول مفصل للتسليم المترجمة إلى الدماغ القوارض مع أو بدون التوجيه التصوير بالرنين المغناطيسي.

يمكن استخدام الموجات فوق الصوتية المركزة مع الفقاعات الدقيقة المنتشرة لتوفير فتحات مؤقتة بحجم المليمتر في الحاجز الدموي الدماغي. يتيح ذلك التوصيل غير الجراحي للعوامل المنتشرة بشكل منهجي لاستهداف مناطق الدماغ. للبدء ، املأ سدادة القسطرة بالمحلول الملحي وقم بتسخين ذيل الفئران بمصباح ، مع الحرص على عدم ارتفاع درجة حرارة.

أدخل قسطرة وريد الذيل قياس 24 التي سيتم استخدامها لتوصيل الفقاعات الدقيقة ، وصبغة إيفانز الزرقاء ، وتباين التصوير بالرنين المغناطيسي gadobutrol في حالة استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي ، والعامل التجريبي المعني. سوف يملأ الدم الغمد عند إصابة الوريد. ببطء ، قم بإزالة الإبرة الداخلية مع دفع الغمد إلى الوريد.

قم بربط قابس القسطرة في نهاية منفذ القسطرة ، بمجرد امتلاء المنفذ بالدم. لف شريط المختبر بعناية حول القسطرة والذيل لإبقائه في مكانه ، بدءا من قطعة صغيرة في الأعلى والعمل في الاتجاه الذيلي. اترك نهاية سدادة القسطرة مكشوفة.

قم بتوصيل خط التخدير بموصل التخدير الموجود على الإطار التجسيمي. ثم قم بتثبيت رأس في الإطار عن طريق وضع الفم على شريط اللدغة ، وتوجيه قضبان الأذن إلى كلتا قنوات الأذن وتشديد مسامير الضبط. انقل إلى سرير التصوير بالرنين المغناطيسي.

باستخدام المعلمات الموضحة في المخطوطة النصية ، اجمع الصور المرجحة T2 الإكليلية والمحورية التي تلتقط الدماغ بأكمله بالإضافة إلى التصوير بالرنين المغناطيسي لقياسات الإحداثيات. في الصور الإكليلية ، ابحث عن الصورة التي يكون فيها الإيماني هو الأكبر ، مما يشير إلى مركز الإيمانية سجل المسافة من أعلى الإيمانية إلى منطقة الدماغ ذات الأهمية بالمليمترات ، في كل من الاتجاه الإنسي الجانبي وفي الاتجاه الظهري البطني.

في الصور المحورية ، ابحث عن الصورة التي تظهر الجزء العلوي من الإيمانية وسجل إحداثيات X و Y لمركز الإمصاف الإحداثيات X و Y لمنطقة الدماغ ذات الاهتمام. احسب المسافة من مركز الإيمانية إلى منطقة الدماغ المستهدفة في كل من الاتجاهين الذيلية والإنسية الجانبية. بعد جمع الإحداثيات ، قم بجمع صور ما قبل المسح.

مع إبقاء في هذا الإطار التجسيمي ، قم بنقله بسرعة من سرير التصوير بالرنين المغناطيسي إلى إعداد FUS العلوي للمقعد. تأكد من بقاء نائما تحت تأثير التخدير. حرك الإطار في حامل الإطار وقم بتثبيته بإحكام في مكانه.

استخدم المقص لحلاقة رأس ، ثم قم بتنظيف الشعر الزائد ووضع كريم مزيل الشعر على فروة الرأس. اتركه لمدة ثلاث دقائق وامسحه بالماء والشاش. إذا كنت تستخدم إرشادات التصوير بالرنين المغناطيسي، فقم بتوصيل المؤشر وحرك المؤشر إلى موقع تصوير الرنين المغناطيسي.

ضع المؤشر في أعلى ووسط التصوير بالرنين المغناطيسي بعد ذلك ، وهي النقطة التي تم من خلالها حساب جميع المسافات في صورة التصوير بالرنين المغناطيسي. قم بإزالة المؤشر وحرك محدد الموضع إلى الإحداثيات الجانبية الوسطى والإحداثيات الذيلية. لعق زر الموضع الفارغ وارفع جهاز تحديد المواقع لأعلى بالضغط على الزر 50 ، للسماح بوضع الحمام المائي وجل الموجات فوق الصوتية.

ضع جل الموجات فوق الصوتية على فروة رأس وضع الحمام المائي فوق ، مع ضغط نافذة شريط البوليميد على الجل ، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هواء في الجل. املأ الحمام المائي بالماء منزوع الغاز. في حالة استخدام محول الطاقة العالية ، قم بخفض جهاز تحديد المواقع بحيث يكون المغناطيس فوق الماء مباشرة.

قم بتوصيل محول الطاقة بجهاز تحديد المواقع عن طريق خفض محول الطاقة بعناية في الماء بزاوية وتوصيل المغناطيس. اخفض محدد الموضع إلى الإحداثيات الظهرية البطنية وقم بتشغيل مضخم طاقة التردد اللاسلكي. حقن مليلتر واحد لكل كيلوغرام من صبغة إيفانز الزرقاء 3٪ عن طريق لصق طرف إبرة في سدادة القسطرة والحقن.

يجب أن يصبح بأكمله أزرق في غضون ثوان ، مما يشير إلى أن القسطرة موضوعة بشكل صحيح في الوريد الذيل. اترك الصبغة تدور لمدة خمس دقائق ، ثم قم بتنشيط الفقاعات الدقيقة عن طريق رجها بعنف باستخدام شاكر الفقاعات. اقلب هذه المحقنة عدة مرات للحصول على توزيع موحد للفقاعات الدقيقة ، ثم قم بإرفاق وملء مجموعة التسريب المجنحة.

ضع المحقنة على مضخة التسريب واضبط مضخة التسريب على توصيل 0.2 مل بمعدل ستة ملليلتر في الساعة ، مما يوفر ضخنا بطيئا للفقاعات الدقيقة خلال التعرض لوحدة الحقن النظيفة لمدة دقيقتين. أدخل الإبرة المجنحة في سدادة القسطرة. قم أولا بتشغيل مضخة التسريب ، وانتظر ثلاث ثوان ، ثم ابدأ علاج FUS بالضغط على زر التشغيل وعلى مولد الوظائف.

كرر هذا مرتين لكل منطقة مع خمس دقائق بينهما للسماح للفقاعات الدقيقة بالتلاش. اضغط على زر التشغيل الموجود في مولد الوظائف مرة أخرى لإيقاف علاج FUS عندما تتوقف مضخة التسريب لمدة دقيقتين. انتظر لمدة خمس دقائق حتى تختفي الفقاعات الدقيقة ، ثم ابدأ التسريب والعلاج الثاني ب FUS.

مباشرة بعد العلاج الثاني ب FUS ، قم بحقن تباين الجادوبوترول والعامل المعني. يجب ألا يتجاوز إجمالي الحجم التسليم لجميع العوامل خمسة ملليلتر لكل كيلوغرام. لتأكيد فتح BBB ، ضع مرة أخرى على سرير التصوير بالرنين المغناطيسي في نفس الموقع بالضبط وقم بتوصيل خط التخدير.

اجمع فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي اللاحقة بنفس معلمات التصوير مثل صور المسح المسبق لتأكيد تحسين التصوير بالرنين المغناطيسي الجادوبوترول في منطقة فتحة BBB. تم استخدام هذا البروتوكول للحث على فتح حاجز الدم الدماغي الموضعي مع كل من محول الغمر منخفض الطاقة ومحول الموجات فوق الصوتية المركز عالي الطاقة. أولا ، تم استهداف محول الغمر منخفض الطاقة إما إلى نصف الكرة المخية الأمامي أو الإنسي.

تم التضحية بالحيوانات مع أو بدون نضح ، وتم تصور فتحة BBB عبر صبغة إيفانز الزرقاء المضان التلقائي. في التجارب اللاحقة ، تم استهداف محول الطاقة FUS إما الحصين أو القشرة الحزامية الأمامية. بالإضافة إلى صبغة إيفانز الزرقاء ، تم استخدام عامل تباين التصوير بالرنين المغناطيسي جادوبوترول للتحقق من الفتحة المستهدفة ل BBB في الجسم الحي.

بعد التضحية بالحيوانات ، أكدت صبغة إيفانز الزرقاء المضان التلقائي موقع الافتتاح. لتقييم ما إذا كان يمكن استخدام هذه التقنية لتوصيل الجينات المستهدفة ، تم حقن تسعة AAV التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر وتباين الجادوبوترول مباشرة بعد فتح الحاجز الدموي الدماغي في الحصين. تم تصوير للتحقق من الفتحة بتباين جادوبوترول.

بعد ذلك ، تم تأكيد تسليم الجينات عن طريق تعبير GFP. يقدم هذا البروتوكول نهجا رائعا لفتح الحاجز الدموي الدماغي بوساطة التصوير بالرنين المغناطيسي بوساطة الموجات فوق الصوتية ، والذي يمكن تكييفه بسهولة من قبل المختبرات الأخرى لتوفير بديل انتقالي غير جراحي للجراحة التجسيمية.