تقييم الإجهاد التأكسدي في العينات البيولوجية باستخدام اختبار المواد التفاعلية حمض ثيوباربيتريك

لذلك من الأفضل استخدام مقايسة TBARS للتقييم العام داخل المختبر للإجهاد التأكسدي في العينات البيولوجية ، حيث تتم مقارنة مستويات TBARS النسبية مباشرة بين العينات التي تم تخزينها ومعالجتها معا. هذه الاختبارات لها تكلفة منخفضة للغاية تبلغ حوالي 3 لاختبار 96 عينة مقارنة بالمجموعات المتاحة تجاريا ، والتي تكلف حوالي 400 ، وتسمح فقط بتحليل عينات دفعة واحدة. يمكن تكييف الطريقة الموضحة هنا بشكل أكبر لتطبيقات محددة بما في ذلك دراسات استقرار العينات الحيوية ، وتلك التي تكون إضافة مضادات الأكسدة أو أنواع أخرى من المواد الحافظة للعينات قبل التحليل مناسبة أو إلزامية.

لتجنب النتائج المتغيرة للغاية ، قم بإعداد كواشف جديدة ، وتأكد من أن الرقم الهيدروجيني لا يزيد عن أربعة لكواشف اللون وقم بإزالة أي فقاعات في صفيحة انتفاخ nidese قبل قياس الامتصاص. ابدأ بتحضير محلول مائي 0.8٪ من حمض ثيوباربيتوريك. قم بإعداد محلول هيدروكسيد الصوديوم بخمسة مولات عن طريق إذابة أربعة جرامات من حبات هيدروكسيد الصوديوم في 20 مل من الماء.

قم بتخزين المحلول في وعاء بلاستيكي. يجب أن تكون طازجة لكل دفعة. أضف أربعة جرامات من حمض الثيوباربيتوريك إلى 450 مل من الماء منزوع الأيونات واستخدم قضيب تقليب مغناطيسي لإذابته برفق.

أضف ببطء ما يقرب من أربعة ملليلتر من محلول هيدروكسيد الصوديوم بزيادات قدرها 100 ميكرولتر ، وتحقق من الرقم الهيدروجيني عندما تذوب جزيئات حمض الثيوباربيتوريك. استمر في إضافة هيدروكسيد الصوديوم حتى تذوب جميع الجزيئات. تحقق من أن الرقم الهيدروجيني للمحلول لا يزيد عن أربعة باستخدام شريط الأس الهيدروجيني ، ثم ارفع الحجم النهائي إلى 500 مل بالماء منزوع الأيونات وقم بتخزين محلول حمض البرباريك المائي في درجة حرارة الغرفة.

قم بإعداد محاليل المنحنى القياسية MDA bis ثنائي ميثيل الأسيتال في أنبوبين من البولي بروبيلين بغطاء مليلتر. عن طريق تخفيف محلول مخزون 200 ميكرومولار في الماء كما هو موضح في المخطوطة النصية. دوامة العينات.

قم بتسمية الأنابيب الزجاجية للعينات المراد تحليلها ، ثم أضف 100 ميكرولتر من العينة المحضرة إلى كل أنبوب. أضف 200 ميكرولتر من 8.1٪ SDS إلى كل عينة وقم بتدوير الأنبوب الزجاجي برفق بحركة دائرية للخلط. أضف 1.5 مل من محلول أسيتات الصوديوم 3.5 مولار إلى كل عينة ، ثم أضف 1.5 مل من محلول حمض ثيوباربيتوريك المائي 0.8٪.

اجلب النهائي في كل أنبوب إلى أربعة ملليلتر عن طريق إضافة 700 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. قم بتغطية الأنابيب الزجاجية بإحكام واحتضانها في كتلة تسخين مضبوطة على 95 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. قم بتغطية الأنابيب بورق الألمنيوم لمنع التكثيف ، ثم قم بإزالة الأنابيب من الكتلة واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة.

بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للعينات والمعايير عند 1 ، 500 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. انقل 150 ميكرولترا من المادة الطافية من كل أنبوب إلى بئر في لوح سعة 96 بئر ، وقم بإزالة أي فقاعات هواء بطرف الماصة. قم بقياس امتصاص العينات عند 532 نانومتر ، ثم اطرح متوسط قراءة الامتصاص للعينات الفارغة من جميع قراءات المواد الماصة الأخرى.

قم بإنشاء منحنى قياسي واستخدمه لحساب تركيزات العينة غير المعروفة. تم إنشاء منحنيات MDA bis dimethyl acetol القياسية لتحديد حدود الكشف وحساسية الفحص ومستويات الأكسدة في ثلاث عينات بيولوجية مختلفة. تم إجراء ما مجموعه 9 فحوصات TBARS على العينات الثلاث في أيام مختلفة.

لتحديد حدود الكشف، تم قياس امتصاص العينات الفارغة في ثلاثة أيام مختلفة. الحد الأدنى لتركيز مادة TBARS اللازمة لإعطاء إشارة ماصة غير ماصة للضوضاء يمكن اكتشافها هو 1.1 ميكرومولار. وتبلغ حساسية المقايسة حوالي 0.0016 وحدة ماصة لكل زيادة في تركيز الميكرومولار.

يمكن استخدام اختبار TBARS للكشف عن التغيرات في بيروكسيد الدهون للمصفوفات البيولوجية المختلفة. لإثبات هذا النحاس اثنين من الكلوريد تم استخدامه للحث على الأكسدة المختبرية لخلية HEPG2 المصل البشري والبروتينات الدهنية منخفضة الكثافة. تم إجراء اختبار TBARS على عينات LDL المحتوية على EDTA ولم تتغير مستويات TBARS بين عينتين نحاسيتين معالجتين وغير معالجتين LDL.

ومع ذلك ، بعد إزالة EDTA عن طريق الترشيح الدوري ، خضع LDL لأكسدة النحاس بوساطة اثنين. لتوضيح النطاق الديناميكي لمقايسة TBARS في المصل البشري ، تمت إضافة تركيز اثنين من أيوني النحاس المليمولار إلى العينات ، مما أدى إلى زيادة ستة إلى سبعة أضعاف في TBARS. عند محاولة هذا البروتوكول ، لا تترك العينات على الجليد لمدة تزيد عن 10 دقائق ، واتركها في درجة حرارة الغرفة بعد الطرد المركزي.

بالنسبة للدفعات أو المجموعات الفرعية من العينات الحيوية التي لم يتم جمعها ومعالجتها وتخزينها معا في الأصل ، يجب على المرء إجراء تقييم إحصائي للبيانات الخاصة بتأثيرات الدفعات للتأكد من أن الأكسدة الاصطناعية لم تساهم في النتائج. الأكسدة المختبرية المقصودة القابلة للقياس الكمي من البروتين الدهني منخفض الكثافة يجعل من الممكن فهم كيفية تأثير الأكسدة على بيولوجيا عملها.