دودة الانحياز Worm_CP، خطين أنابيب مفتوحة المصدر لتقويم و كمية بيانات صورة الفلوريسنس التي تم الحصول عليها من Elegans Caenorhabditis
مايو 28, 2020
دودة محاذاة / Worm_CP هو سير عمل فيجي / CellProfiler بسيطة التي يمكن استخدامها لتصويب ومواءمة Caenorhabditis elegans عينات وتسجيل كامل دودة تستند إلى صورة المقايسات دون الحاجة إلى خطوات التدريب المسبق. لقد طبقنا دودة محاذاة / Worm_CP إلى الكم من الحرارة الناجمة عن التعبير في الحيوانات الحية أو قطرات الدهون في عينات ثابتة.
نحن نصف هنا بسيطة مفتوحة المصدر فيجي القائم على سير العمل المسمى دودة محاذاة، والتي يمكن استخدامها لتوليد المونتاج واحد أو متعدد القنوات من الديدان استقامة من الفائدة من الصور المجهرية الخام. لأن هذا العمل يعتمد على الحيوانات المختارة من قبل المستخدم من الفائدة ، قد يكون من المفيد بشكل خاص عند تحليل الصور من C.elegans حيث لا الديدان كلها في المرحلة الصحيحة أو الشرط. وتجدر الإشارة إلى أن الناتج من محاذاة الدودة يمكن استخدامها في التحديد الكمي اللاحق للفلوريس مع أي فيجي أو غيرها من برامج تحليل الصور.
هنا نبرهن على القياس الكمي الفلوري باستخدام خط أنابيب CellProfiler Worm_CP. ابدأ بإنشاء ميكروبيبت الفم عن طريق تمديد شعري زجاجي رفيع في شعلة شعلة بونسن. بعد التمديد في اللهب، وكسر الشعيرات الدموية إلى قطعتين إذا لم تقتحم إلى قطعتين بعد التمديد.
إذا كان كسر إلى قطعتين، وقطع نهاية أطول واحد. حدد أطول قطعة واختبار ما إذا كان الشعرية مفتوحة من خلال محاولة لpirate المياه. فصل المحول من أنبوب سيليكون ثلاثي المليمتر.
قم بتوصيل الشعيرات الدموية الزجاجية بمحول شعري مرتبط بأنبوب سيليكون من عيار 6 ملليمترات. ثم قم بتوصيل الطرف الآخر من أنبوب الستة ملليمترات في مرشح ميكرومتر 0.2 وأنبوب سيليكون ثلاثي المليمتر على الطرف الآخر. قم بتوصيل طرف مرشح ملليمتر واحد في النهاية الحرة لأنبوب السيليكون ثلاثي المليمتر لتبخر السائل.
تحت مجهر تشريح، وإزالة أكبر قدر ممكن من السائل حول بيليه من الديدان الثابتة مع ميكروبيبت الفم. إضافة بسرعة 10 ميكرولترات من تصاعد المتوسطة إلى الجزء السفلي من الأنبوب. شطف طرف 10 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني مع آثار المنظفات لمنع الديدان من التمسك الجانبين من تلميح الماصات البلاستيكية.
ثم قطع نهاية الحافة مع زوج من مقص. نقل ثمانية ميكروليترات من المتوسطة المتصاعدة مع الديدان على وسادة agarose أعدت سابقا. أثناء مراقبة الشريحة تحت المجهر ، يهيج بلطف لتجنب تداخل الديدان.
ثم تغطية قطرة من المتوسط تصاعد على وسادة agarose مع 18 في 18 ملليمتر coverslip. لتركيب الديدان الحية، ماصة ثلاثة إلى أربعة ميكرولترات من ثلاثة ملليمتر levamisole حل في M9 على وسادة agarose. اختيار 30 إلى 50 الديدان في حالة في قطرة من levamisole.
ثم تغطية قطرة مع 18 في 18 ملليمتر يغطي وصورة الديدان في غضون ساعة واحدة. تثبيت حزمة برامج تحليل الصور مفتوحة المصدر فيجي من ImageJ، أو إذا كان مثبتًا بالفعل على الكمبيوتر، تحقق من أنه الإصدار 1.52A أو الإصدار الأحدث، ثم قم بتنزيل مستودع محاذاة الفيروس المتنقل من GitHub واحفظه على الكمبيوتر. بمجرد أن يتم تنزيل جميع مكونات خط الأنابيب وتثبيتها، افتح Fiji ونفذ الماكرو المتنقل بمحاذاة الفيروس بالنقر فوق المكونات الإضافية ووحدات الماكرو وتشغيلها في شريط القوائم الرئيسي.
حدد موقع محاذاة الفيروس المتنقل. ijm النصي وانقر على فتح. انتقل إلى مجلد الإدخال مع الصور التي سيتم تحليلها وانقر فوق حدد، مع التأكد من أن المجلد المحدد يحتوي على ملفات الصور فقط.
سيقوم الماكرو تلقائياً بإنشاء مجلد إخراج حيث سيتم حفظ كافة النتائج. سيكون اسم المجلد نفس مجلد الإدخال مع الإخراج كـ إصلاح ما بعد. السماح الماكرو لفتح الصورة الأولى في مجلد الإدخال واستخدامه كصورة تمثيلية لاستخراج الإعدادات المطلوبة لإنشاء المونتاج، بما في ذلك عرض الديدان، والسطوع، والتباين.
باستخدام أداة رسم الخط المستقيم، ارسم خطًا عبر عرض الفيروس المتنقل وانقر فوق موافق. استخدم طول هذا الخط لتحديد ارتفاع المناطق التي تم اقتصاصها للفيروسات المتنقلة المفردة. لكل قناة، حدد الاسم، جدول البحث، وما إذا كان يجب تضمينه في المونتاج، ثم انقر فوق موافق. بعد ذلك، اضبط إعدادات السطوع والتباين للقنوات باستخدام أشرطة التمرير. كرر هذه العملية للقنوات المتبقية.
بمجرد أن يتم تكوين كافة الإعدادات، سيتم تسجيلها في جدول إعدادات وحفظها في المجلد الفرعي CellProfiler من مجلد الإخراج. يتم إنشاء صورة لإظهار ما ستبدو عليه جميع الصور بعد تطبيق الإعدادات. إذا كانت الصورة مرضية، ضع علامة على المربع العلوي.
المربع الثاني والثالث من لوحة الاختيار جميع إعدادات تحديد الخيارات لتوليد المونتاج. اترك كلا المربعين علامة وانقر فوق موافق لتنفيذ بقية الماكرو. سيؤدي الفشل في وضع علامة على المربع العلوي إلى إعادة تشغيل الإعداد من قبل الماكرو.
الماكرو ثم ينتقل إلى فتح كافة الصور في مجلد الإدخال. لكل صورة، رسم خطوط على محور طولي من كافة الديدان ليتم تضمينها في المونتاج باستخدام مجزأة أو أداة خط حر. رسم خطوط باستمرار من الرأس إلى الذيل أو العكس بالعكس على طول كامل من الديدان وإضافة كل سطر إلى مدير ROI عن طريق النقر على التحكم T.Once تمت إضافة كافة الديدان المطلوبة، انقر فوق موافق. ثم سيقوم محاذاة الفيروس المتنقل بإنشاء صور مقصوصة من الديدان المحددة المفردة، والتي سيتم حفظها في المجلد الفرعي المتنقل الواحد لمجلد الإخراج.
سيتم حفظ المونتاجات من كافة الفيروسات المتنقلة المحددة في المجلد المحاذى. قم بتنزيل وتثبيت CellProfiler 2.2.0 بالنقر فوق الارتباط للإصدارات CellProfiler السابقة على صفحة التنزيل وتحديد نظام التشغيل المطلوب. قبل بدء تشغيل خط أنابيب Worm_CP تأكد من وجود كافة الصور الإخراج المتوقعة في المجلد الفرعي CellProfiler المجلد إخراج المتنقل محاذاة.
يجب أن تكون هناك نسخة مُعالجة من الصورة الأصلية، وقناع صورة ثنائية للسكان المتنقلين، وقناع محاذاة إذا كان الخط مرسومًا على دودة محددة وصورة واحدة تمثل كل قناة من القنوات في الصورة الأصلية. فتح CellProfiler، ثم انقر على وحدة إدخال الصور واسحب مجلد وحدة CellProfiler إلى النافذة التي تقول إسقاط الملفات والمجلدات هنا. إذا كانت قائمة الصور موجودة من تحليل سابق، قم أولاً بإزالة هذه الصور بالنقر بزر الماوس الأيمن في النافذة وتحديد قائمة ملفات واضحة.
انقر على وحدة إدخال بيانات التعريف وعلى أسلوب الاستخراج الثاني، انقر فوق المجلد الأصفر وانتقل إلى المجلد الفرعي CellProfiler المجلد إخراج المتنقل محاذاة. حدد ملف الإعدادات، ثم انقر على التحديث. بعد ذلك، انقر على أسماء وأنواع وحدة الإدخال، وتأكد من أن جميع الصور المطلوبة لخط الأنابيب موجودة.
قبل تشغيل خط الأنابيب، حدد وجهة لنتائج الإخراج في وحدة المخرجات. استخدم وضع الاختبار لمعرفة كيفية تنفيذ خط الأنابيب بالنقر فوق وضع اختبار البدء والسماح له بتشغيل الصورة الأولى في المجلد. عندما راض عن أداء خط الأنابيب، انقر فوق وضع اختبار الخروج وتحليل الصور.
قبل البدء في التحليل، تأكد من أن جميع العيون أمام وحدة التحليل مغلقة. عند اكتمال التحليل، افتح مجلد الإخراج Worm_CP الذي يتكون من ملفين CSV وDدان CSV وSdds CSV. زراعة وتصوير C.elegans وفقا للطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول تنتج صور كبيرة نظرة عامة من السكان دودة.
يعتمد إنتاج خط الأنابيب إلى حد كبير على جودة الخطوط المرسومة فوق الصور. تظهر هنا أمثلة السطر عدة والإخراج الخاصة بهم من محاذاة دودة. عند استخدام البرنامج النصي المتنقل، يمكن تحديد الهوية المرئية للدود المتقاطعة من صور التراكب الموجودة في المجلد الفرعي للبيانات، وكذلك من لوحات الديدان الفردية في المونتاج.
ويمكن أيضاً استخدام جدول مراقبة الجودة لتحديد الديدان المتداخلة. ومع ذلك، خطوط المتقاطعة هي مشكلة لخط Worm_CP. وذلك لأن Worm_CP يستخدم قناع الخط، وليس المناطق ذات الأهمية، للمساعدة في تحديد الديدان الفردية.
لذلك، سيتم تقسيم CellProfiler أحد من الفيروسات المتنقلة ككائنين. وقد استخدم خط أنابيب Worm_CP لقياس شدة الفلور من الحيوانات الثابتة التي تحمل صبغة فلورية تدمج في قطرات الدهون. وينخفض محتوى قطرات الدهون بنسبة 17٪ بين نوع البرية والحيوانات DBL1 متحولة باستخدام القياس الكمي اليدوي، و 12٪ باستخدام خط أنابيب Worm_CP.
Worm_CP أيضاً لقياس استجابة الصدمات الحرارية في الديدان الحية التي تعبر عن GFP تحت السيطرة على جين غير قابل للعلاج بالصدمة الحرارية. في غياب الإجهاد الحراري، لم تستحث الديدان تعبير GFP. عندما تتعرض الديدان كصدمة حرارة قصيرة، يتم حدوث تعبير GFP.
يعتمد إخراج Worm_CP إلى حد كبير على جودة الخطوط التي ترسمها باستخدام محاذاة Worm. تأكد من أن خطوطك لا تلمس أو تتداخل ورسم كل ما تبذلونه من خطوط في نفس الاتجاه. يمكن أن يساعدك فحص جدول مراقبة الجودة في تحديد الخطوط التي يتم لمسها أو تداخلها حتى تتمكن من استبعاد تلك الحالات من تحليلك.
ويمكن استخدام ناتج محاذاة الدودة في القياس الكمي اللاحق إما في فيجي أو في حزم برامج تحليل الصور الأخرى. لقد أظهرنا هنا خط أنابيب CellProfiler الأساسية للغاية التي يمكن دمج وحدات التحليل الأخرى بسهولة ، على سبيل المثال ، لحساب عدد قطرات الدهون أو لقياس شدة قطرات فردية داخل دودة. واحدة من ميزة هذه التقنية هي إمكانية قياس الفلورية من الديدان الفردية بسرعة.
في مختبرنا ، لدينا مصلحة في الجدوى الفردية باستخدام مراسلي الفلوريسنس ونستخدم دودة الانحياز Worm_CP بشكل روتيني لهذا الغرض.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة Worm-align، سير عمل قائم على FIJI مفتوح المصدر مصمم لمحاذاة وتصويب عينات Caenorhabditis elegans (C. elegans). يسهل سير العمل تحليل شدة التألق من خلال خط أنابيب Worm_CP ويمكن تطبيقه لتحديد كمية التعبير الناجم عن الصدمة الحرارية وتصوير القطرات الدهنية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- الفحص المجهري
- تحليل الصور
- تقييم كمي
الخلفية
- يمكن أن يكون محاذاة صور C. elegans تحديًا بسبب الاختلافات في مراحل الديدان.
- غالبًا ما تتطلب الطرق الحالية خطوات تدريب مكثفة تعقد تحليل الصور.
- هناك حاجة إلى حل بسيط لتبسيط سير عمل التحليل.
الطرق المستخدمة
- FIJI (ImageJ) لمعالجة الصور
- Caenorhabditis elegans كنموذج بيولوجي
- CellProfiler لتحديد كمية التألق
النتائج الرئيسية
- يسمح سير عمل Worm-align بالتصويب والتحريك الفعال للدود الفردية.
- يظهر التحليل الكمي للتألق تقييمًا ناجحًا لاستجابة الصدمة الحرارية ووجود القطرات الدهنية.
- تقلل كفاءة سير العمل من تعقيد تحليل الصور.
الاستنتاجات
- تظهر الدراسة نهجًا مبسطًا لتحليل صور C. elegans.
- يوفر Worm-align أداة قيّمة للأبحاث البيولوجية المستقبلية التي تحتاج إلى تقنيات تصوير وتحديد كمي دقيقة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
High-content imaging of C. elegans is often limited by clustering and overlap, impeding quantitative analysis and reproducibility in discovery-stage research. The Worm-align and Worm_CP pipelines enable standardized, user-driven straightening and quantification of fluorescence data, supporting robust phenotypic screening and target validation. These open-source workflows enhance predictive confidence and streamline data integration across early discovery and preclinical research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise quantification of reporter gene expression and phenotypic markers in individual worms.
- Supports functional target validation by reducing ambiguity from overlapping or misaligned samples.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of genetic or chemical perturbations in disease-relevant models.
- Improves portfolio triage by providing reproducible, quantitative outputs for candidate prioritization.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, straightened worm images for downstream high-content screening workflows.
- Standardizes image processing and quantification, enhancing assay reproducibility and scalability.
- Enables reliable evaluation of compound effects on fluorescence-based phenotypes.
- Supports platform reuse by integrating with open-source tools like FIJI and CellProfiler.
Translational & Preclinical Research
- Aligns quantitative imaging outputs with translational biomarker studies in C. elegans models.
- Maintains continuity from early discovery through preclinical validation by supporting consistent data formats.
- De-risks mechanistic studies by enabling robust, single-worm quantification across experimental conditions.
Pipeline & Workflow Integration
Worm-align and Worm_CP position imaging data for seamless progression from early discovery through lead identification and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway analysis by enabling accurate, single-worm quantification.
- Screening: Delivers standardized, montage-ready images for reproducible assay development and compound screening.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence measurements and CSV outputs for cross-condition comparison.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and continuity in disease-relevant C. elegans models.
- Enterprise Reuse: Offers open-source, adaptable workflows for repeated use across diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in phenotypic assays.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence imaging and manual annotation for optimal segmentation.
- Needs access to FIJI (ImageJ) and CellProfiler software with compatible versions.
- Demands cross-team standardization of image acquisition and annotation protocols.
- Adaptable to various fluorescence markers and experimental designs in C. elegans research.
- Dependent on quality of manual line annotation; overlapping lines can affect segmentation accuracy.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:57
Mounting Fixed Worms for Imaging
2:56
Creating Montage Images of Aligned Single Worms Using the Worm-align FIJI Pipeline
6:01
Analyzing Single-worm Fluorescence Intensity Using the Output from Worm-align in an Automated CellProfiler Pipeline
8:07
Results: Fluorescence Quantification with the Worm_CP Pipeline
9:50
Conclusion
