استخدام Elegans Caenorhabditis إلى الشاشة لتفاعلات Chaperone الأنسجة محددة

الهدف العام للتجربة التالية في تصميم قابل للتتبع وراثيا Caenorhabditis elegans هو تحديد تفاعلات المرافق الخاصة بالأنسجة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تجمع بين المقايسات سهلة الاستخدام مثل تركيب الذكاء الاصطناعي في الجولان والقراءات السلوكية لكشف التفاعلات الجديدة الخاصة بالأنسجة. من أجل تزامن الجنين غير المجهد ، استخدم معول دودة لنقل حوالي 100 بيضة من صفيحة دودة غير متزامنة إلى صفيحة NGM مثبتة حديثا وزراعة وفقا للجدول الزمني التجريبي المناسب.

عندما تصل إلى اليوم الأول من وضع البيض ، أضف ببطء ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت M9 إلى اللوحة ، بعيدا عن العشب البكتيري ، وقم بتدوير اللوحة بحيث يغطي المخزن المؤقت اللوحة بالكامل. قم بإمالة اللوحة إلى جانب واحد لإزالة السائل وغسل من اللوحة. عندما يتم غسل جميع الديدان من اللوحة ، استخدم طرف ماصة بلاستيكي قياسي لقطع مربع من أجار حول مكان تركيز البيض ووضع قطعة أجار على طبق NGM مثبتة حديثا.

ازرع البيض في نفس ظروف الاستزراع. في نهاية الحضانة ، يجب تغطية اللوحة بالبيض المتزامن. بعد غسل جميع من اللوحة كما هو موضح للتو ، أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت M9 الطازج واستخدم مكشطة خلية لتحرير البيض من اللوحة.

عندما يتم فصل كل البيض ، انقل الحجم الكامل للمخزن المؤقت من اللوحة إلى أنبوب مخروطي الشكل للطرد المركزي. الطرد المركزي الأنبوب والتخلص من المادة الطافية. بعد إزالة المادة الطافية ، أضف ما يصل إلى ملليلتر واحد من المخزن المؤقت M9 الطازج إلى اللوحة والماصة لإعادة تعليق البيض.

اغسل البيض خمس مرات أخرى كما هو موضح للتو. بعد الغسيل الأخير ، يجب أن تظهر حبيبات البيض بيضاء ويمكن إزالة جميع المواد الطافية باستثناء آخر 200 ميكرولتر. لزراعة الديدان الخيطية المتزامنة لإجراء تجربة ، ضع قطرة من حوالي 30 بيضة بالقرب من العشب البكتيري وكل صفيحة جالسة للحمض النووي الريبي متداخل وحوالي 30 بيضة على صفيحة جالسة بها ناقلات فارغة تحتوي على بكتيريا.

ثم قم بزراعة في ظل ظروف الاستزراع المناسبة وفقا للبروتوكول التجريبي. لتقييم الفتك الجنيني للحيوانات المتزامنة ، عندما تبدأ في وضع البيض ، انقل حوالي 100 بيضة إلى طبق فارغ وانشر البيض في صفوف لتبسيط العد. بعد 24 إلى 48 ساعة ، سجل النسبة المئوية للبيض غير المفرغ.

كمرجع ، قارن بيض التجربة ببيض المعالجة ببكتيريا مكافحة النواقل الفارغة. لإعداد اختبار الشلل ، قم بزراعة المتزامنة مع العمر على بكتيريا التحكم في النواقل الفارغة ، حتى تصل إلى سن الرشد ، ولكن قبل أن يبدأ وضع البيض. استخدم قلم تحديد دقيق لرسم خط على الجزء الخلفي من لوحة NGM Agar العادية ، وضع خمسة إلى عشرة على الخط المحدد.

اضبط مؤقتا لمدة 10 دقائق وسجل النسبة المئوية للحيوانات المتبقية على الخط كديدان مشلولة. كمرجع ، قارن هذه البيانات بالنسبة المئوية للحيوانات الطافرة التي نمت على بكتيريا مكافحة النواقل الفارغة. للتحقق من صحة ضربة قاضية للبروتين ، ضع 250 إلى 300 بيضة متزامنة على صفيحة RNA متداخلة NGM مقاس 60 ملم جالسة مع الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل أو ناقلات فارغة تحتوي على بكتيريا ، وقم بزراعة البيض للفترة التجريبية المناسبة.

في نهاية الحضانة ، انقل ما مجموعه 200 بالغ إلى غطاء أنبوب سعة 1.5 مليلتر يحتوي على 200 ميكرولتر من PBST يتم الاحتفاظ به في درجة حرارة زراعة. أغلق الغطاء بعناية ، وقم بالطرد المركزي للحيوانات عند 1000 مرة G لمدة 1 دقيقة. في نهاية الطرد المركزي ، أضف 800 ميكرولتر من PBST الطازج إلى الأنبوب وقم بالطرد المركزي للديدان مرة أخرى.

قم بإزالة أعلى 900 ميكرولتر من المادة الطافية بعناية ، واغسل الديدان الخيطية في PBST الطازجة 3 مرات أخرى كما هو موضح للتو. بعد الغسيل الأخير ، قم بإزالة جميع المواد الطافية باستثناء آخر 100 ميكرولتر وأضف 25 ميكرولترا من المخزن المؤقت للعينة 5X إلى. قم بتسخين العينات لمدة 10 دقائق عند 92 درجة مئوية و 1000 دورة في الدقيقة ، قبل تحميل 20 ميكرولترا من كل عينة على جل صفحة SDS.

ثم قم بإجراء تحليل اللطخة الغربية باستخدام الأجسام المضادة المناسبة لتحديد الاستقرار النسبي للبروتين محل الاهتمام ، واستخدم برنامج قياس الكثافة لتحديد شدة الحظر. يؤدي HSP6 الذي تم إسقاطه أثناء التطوير إلى توقف نمو قوي في البرية. في الوقت نفسه ، لا يسبب HSP6 الذي تم إسقاطه في سلالة الحمض النووي الريبي التداخل العضلي التي تعبر عن RDE1 من النوع البري في الأنسجة العضلية توقف النمو.

في حين أن HSP6 أسقط سلالة RNAI خاصة بالأمعاء تعبر عن النوع البري RDE1 في الخلايا المعوية ، ينتج عنه توقف نمو قوي ونمط ظاهري. لذلك ، يمكن استخدام طفرة في HSP6 MG585 تسبب تأخيرا خفيفا في النمو للكشف عن تفاقم أو تخفيف تفاعلات المرافق عن طريق عبور سلالة تحمل هذا الجين المتحور إلى سلالة الحمض النووي الريبي للتداخل المعوي ، وفحص مكتبة الحمض النووي الريبي لتداخل المرافق. يشبه تنظيم الميوسين الطافرة UNC45 المعالجة بالحمض النووي الريبي التداخل STI1 AHSA1 أو DAF41 ، تلك الموجودة في الديدان البرية في مرحلة اليرقات الرابعة.

على الرغم من أن المسوخ تظهر قسما معطلا بعد بلوغهم سن الرشد. في المقابل ، لا تزال كل من الطافرة UNC45 التي عولجت بمكافحة ناقلات فارغة البرية غير متأثرة. التفاعلات الجينية لا تدل على التفاعل الجسدي.

وبالتالي ، يجب إجراء تجارب المتابعة باستخدام شاشة التفاعل الجيني للتحقق من صحة طبيعة التفاعلات المحددة وفحصها مباشرة.