نماذج متقدمة الكبد 3D لاختبار السمية الجينية في المختبر بعد التعرض للمواد النانوية على المدى الطويل

وقد ثبت أن هذا الإجراء يستخدم لتطوير ثقافات كبدية ثلاثية الأبعاد متقدمة في المختبر، والتي يمكن أن توفر تقييما أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية للمخاطر الجينية المرتبطة بالتعرض للمواد النانوية على حد سواء على المدى الحاد أو الطويل، نظم الجرعة المتكررة.

يوفر نموذج Hep G2 هذا بديلا مناسبا لنظام الاختبار في المختبر لتقييم الحث المحتمل لتلف الحمض النووي الثابت بعد التعرض طويل الأمد للمواد النانوية بهدف تقليل الحاجة إلى الاختبار على. يمتلك نموذج Hep G2 الكروي القدرة على البقاء قابلا للحياة وعمليا على مدى فترة 14 يوما ، بالإضافة إلى الحفاظ على مستوى مناسب من الانتشار. يدعم هذا اختبار مجموعة من نقاط النهاية الكيميائية الحيوية والسمية الجينية ، بما في ذلك اختبار النواة الدقيقة.

قبل محاولة هذا البروتوكول ، أقترح عليك القيام ببعض عمليات التدريب أولا. توخ الحذر عند بذر الخلايا أو تغيير الوسائط ، لأن ذلك يتطلب نهجا دقيقا. ابدأ بإضافة 100 ميكرولتر من PBS المعقمة بدرجة حرارة الغرفة إلى آبار لوحة ثقافة 96 بئر.

اقلب غطاء اللوحة وقم بعمل ماصة بعناية 20 ميكرولتر قطرة من تعليق الخلية في وسط كل أخدود بئر للغطاء. استخدم ماصة متعددة القنوات، مع إضافة قطرتين إلى أربع قطرات في المرة الواحدة، لضمان دقة الوضع. قم بزرع أربعة منشطات فقط في المرة الواحدة وتأكد من محاذاة أطراف الماصة قبل البدء.

ستحدث الزاوية التي تمسك بها القناة المتعددة فرقا في طريقة تكوين الكرات الكروية. تأكد من أن القطرات متمركزة داخل أخاديد الآبار الموجودة على الغطاء ، ثم اقلب الغطاء برفق أعلى اللوحة بحيث تتدلى القطرات فوق الآبار باستخدام PBS. احتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام قبل نقل الكروية إلى الاغاروز.

بعد الحضانة ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة وارفع الغطاء بعناية عن اللوحة ، وتخلص من PBS ، واضغط على اللوحة لإزالة أي سائل متبقي ، واترك الألواح تجف في الهواء لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. بعد إذابة الاغاروز ، قم بتدويره برفق لإزالة أي فقاعات وإضافة 50 ميكرولتر إلى قاعدة كل بئر. اترك الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين ، ثم أضف 100 ميكرولتر من DMEM الدافئ مسبقا فوق طبقة الاغاروز الصلبة في كل بئر.

ضع الغطاء مع هذه القطرات الكروية مرة أخرى أعلى اللوحة بحيث تتدلى الكرات مرة أخرى ، ثم قم بالطرد المركزي للوحة لمدة ثلاث دقائق عند 200 مرة G لنقل الكرات إلى الآبار الفردية للوحة. احتضن الطبق لمدة 24 ساعة أخرى للسماح للكرات بالاستقرار. بعد تشتت المواد النانوية الهندسية ، أو ENMs ، قم بتخفيفها إلى التركيز النهائي المطلوب باستخدام DMEM الدافئ مسبقا.

استنشق 50 ميكرولترا من الوسط من كل بئر باستخدام الكرات واستبدلها ب 50 ميكرولترا من الوسط باستخدام ENM. لحصاد الكرويات ، استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لشفط 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا مع الأنسجة الكروية من كل بئر ، مع الحرص على تجنب ملامسة الاغاروز. اجمع الكرويات في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 ملليلترا.

بالطرد المركزي للتعليق الكروي عند 230 مرة G لمدة خمس دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى مزيد من التحليل. اغسل حبيبات الكرات في مليلتر واحد من PBS المعقم بدرجة حرارة الغرفة ، ثم قم بطردها بمعدل 230 مرة G لمدة ثلاث دقائق وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الكرات في 500 ميكرولتر من محلول 0.05٪ Trypsin-EDTA واحتضانها لمدة ست إلى ثماني دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد الحضانة ، قم بتقطيع خلايا Hep G2 المثقبة برفق لأعلى ولأسفل لتفكيكها بالكامل وإعادة تعليقها قبل تحييدها باستخدام مليلتر واحد من DMEM. الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 230 مرة G لمدة خمس دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلترين من PBS. لإنشاء قمع كوفيت ، ضع شريحة المجهر المعدة في الدعامة المعدنية ، ضع بطاقة مرشح أعلى الشريحة ، ثم قم بتأمين قمع الكوفيت في الأعلى.

رتب قمع الكوفيت في جهاز الطرد المركزي الخلوي بحيث يكون القمع متجها لأعلى بحيث يمكن إضافة 100 ميكرولتر من معلق الخلية مباشرة إلى كل واحدة. ثم تابع إصلاح الشرائح وفقا لتوجيهات المخطوطة. قم بإعداد محلول تلطيخ Giemsa بنسبة 20٪ مخفف في محلول الفوسفاتيز.

بتمرير المحلول برفق لأعلى ولأسفل لخلطه، ثم قم بتصفيته بورق ترشيح مطوي في قمع. استخدم ماصة باستور لإضافة ثلاث إلى خمس قطرات من محلول Giemsa المصفى إلى النقطة الخلوية في كل شريحة واتركها لمدة ثماني إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح في غسلتين متتاليتين من الفوسفاتيز.

ثم اشطفها لفترة وجيزة تحت الماء البارد لإزالة أي بقعة زائدة واتركها لتجف في الهواء. قبل إجراء أي تقييم سمي في المختبر ، من المهم التحقق من أن الكرات الكروية 3D HepG2 قد تشكلت بشكل صحيح. بعد أربعة أيام من البذر ، يجب أن تتشكل كرات كروية مدمجة ذات سطح أملس ولا توجد إسقاطات بصرية.

عرض الكرويات ذات الجودة الجيدة والجودة الرديئة بعد أربعة أيام من البذر هنا. عادة ما تتشكل 90 إلى 95٪ من الكرات الكروية المتكونة لكل لوحة بشكل صحيح وتكون قابلة للتطبيق لمزيد من التجارب. تم تقييم الجدوى والوظائف الشبيهة بالكبد على مدى فترة استزراع مدتها 14 يوما لتحديد طول عمر النموذج الكروي للكبد وتحديد ما إذا كان بإمكانه دعم تقييم المخاطر الكروية على المدى الطويل أو الكيميائية.

ظل تركيز الألبومين ثابتا طوال فترة الاستزراع ، بينما زاد إنتاج اليوريا لكل كروي قبل أن يبدأ في الانخفاض في اليوم 14. لتقييم السمية الجينية ، تم استخدام مقايسة النواة الدقيقة لتحديد وجود النوى الدقيقة بعد التعرض الحاد والطويل الأمد ل ENM. تعرضت الكرويات لاثنين من ENMs ، ثاني أكسيد التيتانيوم والفضة.

لوحظ اتجاه مماثل للسمية الجينية بعد التعرض الحاد لكل من ENMs ، لكن استجابة السمية الجينية المرتفعة لم تكن واضحة بعد التعرض طويل الأمد لمدة خمسة أيام. باتباع هذه الطريقة ، يمكن حصاد كل من المادة الطافية والكروية للعديد من نقاط النهاية الكيميائية الحيوية. وتشمل هذه قابلية الخلية للحياة ، ومقايسات وظائف الكبد ، وتحليل SID 450 ، وعلامات الالتهابات الضعيفة ، والتعبير الجيني.

يتم اختبار هذه التقنية حاليا في عدد من مختبرات الأبحاث التعاقدية التي ترغب في تطبيقها على اختبار السمية الأرضية الروتيني لكل من المواد الكيميائية والمواد النانوية. هذا لديه القدرة على تقليل الاعتماد على مناهج الاختبار في الجسم الحي.