الفحص الفلوري القائم على كيمياء النقر ل Apolipoprotein N-acyltransferase من توصيف الإنزيم إلى الفحص عالي الإنتاجية

يعالج هذا البروتوكول جانبين مهمين ، توصيف غشاء متكامل أساسي ، صميم البروتين الشحمي أسيل ترانسفيراز البكتيريا ، وتطوير الاختبار بتنسيق HDS للكشف عن مثبطات الإنزيم. الطريقة حساسة للغاية ومناسبة لأغراض الفحص. يمكن أن يساهم في تطوير مضادات حيوية جديدة محتملة.

سيساعد هذا الفيديو في تسليط الضوء على الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول ، مثل الخلط ، والدوامة ، والصوتنة ، أثناء العمل مع الدهون غير المتجانسة والمنظفات التي تحتوي على تعليق. ستظهر الإجراء كارين نوزريت وأوريليا بيرنين ، وكلاهما زملاء في مجموعتي. ابدأ بتحضير خليط الكاشف لمقايسة صميم البروتين الشحمي والأسيل ترانسفيراز أو LNT.

امزج الألكين POPE و FSL-1-biotin مع محلول تفاعل LNT في أنابيب 1.5 مليلتر بحجم نهائي قدره 18 ميكرولترا. قم بإعداد مخاليط الكاشف ثلاثية النسخ لجميع الظروف المختبرة. قم بتقطيع مخاليط الكاشف لمدة ثلاث دقائق في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

ثم أضف LNT النشط أو غير النشط إلى التركيز النهائي البالغ نانوغرام واحد لكل ميكرولتر ، وقم بالماصة لأعلى ولأسفل للخلط. احتضان التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة في خلاط حراري بغطاء ساخن. في هذه الأثناء ، قم بإعداد محلول مخزون من ملليغرام لكل مليلتر ستربتافيدين.

وتخفيفه إلى 10 ميكروغرام لكل مليلتر لإنشاء حل عملي. أضف 100 ميكرولتر من المحلول إلى كل بئر من لوح 96 بئر. ثم جفف الآبار بالهواء طوال الليل عن طريق احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية بدون غطاء.

في اليوم التالي ، قم بإعداد محاليل مخزون من خمسة ملليمولار Azido-FAM ، و 50 ملليمولار TCEP ، واثنين من المليمولار TBTA ، و 50 ملليمولار خماسي هيدرات كبريتات النحاس. قم بإجراء كيمياء النقر عن طريق إضافة 0.2 ميكرولتر من Azido-FAM ، و 0.4 ميكرولتر من TCEP ، و 0.2 ميكرولتر من TBTA إلى أنابيب تفاعل LNT سعة 1.5 مل. دوامة الحل لمدة خمس ثوان.

ثم أضف 0.4 ميكرولتر من كبريتات النحاس. دوامة لمدة خمس ثوان أخرى واحتضان التفاعل لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. أثناء احتضان خليط كيمياء النقر ، اغسل آبار الألواح المطلية بالستربتافيدين ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من PBST1.

انقل 18 ميكرولترا من خليط كيمياء النقر إلى بئر مطلي بالستربتافيدين ، وأضف 100 ميكرولتر من PBST1 لربط منتج N-acyl-FSL-1-biotin FAM باللوحة. أضف فلوريسين البيوتين إلى اللوحة كعنصر تحكم إيجابي لربط الستربتافيدين وقراءة الفلورة. ثم احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في الظلام ، مع الرج عند 300 دورة في الدقيقة.

بعد الحضانة ، استخدم ماصة إلكترونية متعددة القنوات لغسل اللوحة يدويا ست مرات باستخدام 200 ميكرولتر من PBST2. اغسلها ثلاث مرات باستخدام الماصة. اغسلها ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من PBS واغسلها ثلاث مرات أخرى.

أضف 200 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر ، واكتشف التألق عند 520 نانومتر في قارئ صفيحة دقيقة. احفظ جميع النتائج في جدول بيانات، ثم احسب الانحراف المعياري لكل تفاعل بالإضافة إلى قيم P للعناصر الضابطة السلبية والعينات الإيجابية باستخدام اختبار T غير المقترن. يستخدم اختبار LNT الموصوف هنا الفوسفوليبيدات التي تحتوي على حمض الألكين الدهني و FSL-1-biotin كركائز لتكوين الألكين FSL-1-biotin.

عند تفاعل كيمياء النقر مع Azido-FAM ، يصبح هذا المنتج مسمية بالفلورسنت ويمكن اكتشافه عن طريق قياس الطيف الفلوري. تم تحسين ظروف التفاعل للحصول على أقصى قراءة مضان عند 520 نانومتر. تضمنت الضوابط السلبية تفاعلات بدون إنزيم ، مع متغير غير نشط من الإنزيم ، أو مع مثبط خاص بالثيول ، MTSES.

تم استخدام فلوريسين البيوتين كعنصر تحكم داخلي لأقصى إشارة مضان من أجل تطوير اختبار فحص عالي الإنتاجية ، تم إجراء التفاعلات مباشرة في 384 لوحة بئر. تم أتمتة خطوات الغسيل وتم تقليل كمية الكواشف.

كان التفاعل حساسا وقابلا للتكرار مع اختلاف كبير في إشارة الفلورسنت بين التحكم السلبي والإنزيم النشط. بالنسبة للفحص عالي الإنتاجية ، يحدد العامل الأولي Z ما إذا كانت الاستجابة في الفحص كبيرة بما يكفي لأغراض الفحص. كان متوسط العامل الأولي Z أكبر من 0.6 لمقايسة LNT التي تم إجراؤها بتنسيق 384 بئر ، مما يشير إلى أنه كان رائعا.

تم تطوير مقايسة الأنبوب في هذا الفيديو بتنسيق متعدد اللوحات متوافق مع HDS. يمكن استخدامه لدراسة أسيل ترانسفيراز أخرى من مجموعة متنوعة من الكائنات الحية.