نظام Gnotobiotic لدراسة تجميع الميكروبيوم في Phyllosphere وفي تخمير الخضروات

باستخدام هذا البروتوكول، يمكننا معالجة الأسئلة الرئيسية المتعلقة بكيفية تجميع الميكروبات وتفاعلها في الغلاف السفلي. لديها فائدة إضافية أنه باستخدام مستخلص الخضار العقيمة، يمكننا ربط هيكل المجتمعات فيلو الكرة إلى وظيفتها أثناء تخمير الخضروات. هذه التقنيات تمكن العلماء من اختبار كيفية تفاعل الميكروبات في مجال فيلو ومن ثم تتبع كيف يمكن لهذه المجتمعات فيلو المجال يمكن أن تؤثر على التخمير.

لسطح تعقيم بذور الملفوف، تبدأ من خلال وضع 100 البذور في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر. إضافة ملليلتر واحد من 70٪ الإيثانول إلى الأنبوب ودوامة لمدة خمس دقائق. ثم استخدام ماصة لتجاهل الإيثانول.

إضافة ملليلتر واحد من 50٪ التبييض ودوامة الأنبوب لمدة خمس دقائق، ثم تجاهل التبييض. شطف البذور أربع مرات، عن طريق إضافة ملليلتر واحد من المياه الأيونية autoclaved دوامة الأنبوب، ثم التخلص من الماء. بعد الشطف الأخير ، نقع البذور في المياه المعقمة الأيونية لمدة ساعتين إلى ثماني ساعات لتليين معطف البذور قبل الزراعة.

تزن 10 غراما من الطين نظيفة الكالسيوم في أنبوب زجاجي 15 في 2.5 سم. إضافة ما يقرب من تسعة ملليلتر من مرق MS المعدة لكل أنبوب لتغطية الطين الكالسيوم. سقف فضفاضة الأنابيب الزجاجية مع 22 ملليمتر قبعات أنبوب اختبار الطريقين.

اُنسج الأنابيب عند 121 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. عند إزالة الأنابيب من الأوتوكلاف، ادفع القبعات على الأنابيب الزجاجية لختمها، ثم تبريد الأنابيب إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. عندما تبرد الأنابيب، وتستخدم ملقط طويلة اضافية لوضع بلطف واحد بذرة الملفوف العقيمة في وسط كل أنبوب.

الدانتيل الأنابيب في علبة سبعة طريقة ووضع صينية تحت رفوف خفيفة مع دورة ضوء 16 ساعة في 24 درجة مئوية. سوف البذور تطوير أوراقها الحقيقية الأولى بعد خمسة أيام، والتي هي أول ورقة الأوعية الدموية بعد أن شكلت كوتيليفدون. لديها حافة التجاعيد ومغطاة في tricombs.

لاختبار الملفوف الخالي من الجراثيم للعقم ، أمسك قاعدة النبات بلطف بالملباب المعقمة وسحبها. قبل إزالة الملفوف بالكامل من الأنبوب ، قطع الجذور بعناية بمقص تشريح معقمة. ثم, ضغط أوراق الملفوف في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر.

إضافة 400 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني إلى كل أنبوب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة واستخدام آفة صغيرة معقمة لتجانس الملفوف. شفرة 100 ميكرولترات من الملفوف تجانس على لوحات أجار، مع التأكد من استخدام طرف ماصة الفوهة واسعة. لجعل الأسهم الجلسرين من سلالات تلقيح, خط بلطف من المستعمرات الفردية على اثنين أو ثلاثة لوحات جديدة من نفس وسائل الإعلام.

صف المستعمرات لمدة يومين إلى خمسة أيام، ثم كشط لهم من لوحات في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر مع 15 ملليلتر من 15٪ الجلسرين. دوامة الأنبوب جيدا لخلط. Aliquot ملليلتر واحد من مخزون الجلسرين المختلط إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير وتخزينه 80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام مع 14 ملليلتر المتبقية من مخزون الجلسرين.

قبل أسبوع واحد من الاستخدام ، اذيب aliquot على الثلج في ملليلتر واحد وضعه في عدة تمييعات مختلفة لتحديد تركيز مخزون التطعيم. عندما تكون على استعداد لتطعيم الملفوف، ذوبان مخزون الجلسرين على الجليد وتمييعه إلى التركيز المطلوب. إضافة 10 ملليلتر من المخزون المخفف إلى زجاجة مضخة معقم وضخ خمسة بخاخ في منقار جمع النفايات الكبيرة.

إزالة الغطاء من أنبوب الملفوف وإمالة الملفوف نحو زجاجة رذاذ. رش كل ملفوف بثلاث مضخات من محلول التطعيم، ثم قم بحصاد مجموعة فرعية من الملفوف لتقييم تركيز التطعيم الفعلي للمدخلات. لحصاد الملفوف، قم بإزالته من الأنبوب باستخدام ملقط معقمة.

قطع الجذور مع مقص تشريح معقمة ووضعها بعناية في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير وزنها قبل معقمة. سجل وزن الملفوف للحسابات المستقبلية. إضافة 400 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني إلى كل أنبوب مع الملفوف وطحن 30 مرة مع الحشرات الصغيرة، ثم لوحة المتجانسة الملفوف باستخدام نصائح الفوهة واسعة ماصة.

إزالة وتجاهل الأوراق الأبعد من الملفوف وختم جميع الملفوف المتبقية لتناسب الخلاط. مزجه إلى لب ناعم ويزن المتجانس الملفوف. إضافة ملليلترين من الماء المقطر لكل غرام من الملفوف.

ثم تصفية الطين الملفوف من خلال طبقتين من مرشحات القهوة سلة. توزيع الطين في أنابيب الطرد المركزي والطرد المركزي في 20،000 مرة G لمدة 20 دقيقة أو حتى الجسيمات الكبيرة تستقر من الحل. إزالة فائقة، مع الحرص على عدم إزعاج حطام الملفوف بيليه.

لإعادة تهيئة ظروف التخمير بتركيزات ملحية قياسية، أضف 2٪ من الوزن إلى كلوريد الصوديوم بحجم إلى المصطف. بيلدر استخراج الخضار مع مرشح 0.2 ميكرومتر تعلق على فراغ، الاستغناء عنه في أنابيب معقمة وتجميده في ناقص 80 درجة مئوية. تم اختبار طريقة تعقيم البذور مع العديد من الكرنب نابا وأظهرت جميعها معدلات نمو مماثلة.

ومع ذلك ، أعطى أنواع أخرى من النحاس نجاحا محدودا لأن النباتات إما انخفاض معدلات الإنبات بعد التعقيم أو الجذعية ممدود بسرعة لجعل نبات غير صحي مغزل. تم تلقيح المعزولات الميكروبية إما كسلالات منفردة تعزل أو بالاشتراك مع عزل آخر. وتم اختبار ما مجموعه 15 ملفوفاً خالياً من الجراثيم لكل علاج وحصادها إما على الفور أو في أربعة أيام أو بعد 10 أيام من التطعيم.

أظهرت العزلات نموًا سريعًا في ملفوف نابا فيلوسفير. تم تلقيح اثنين من الخمائر وثلاث بكتيريا في ثلاثة أنواع مختلفة من مستخلص الخضار العقيم أو SVE مصنوعة من الكرنب الأحمر والأخضر والنابا. تم تسجيل نمو التلقيحات على مدى 14 يومًا عن طريق طلاء خمسة ميكرولترات من كل علاج على إما لوحات MRS أو YPD agar.

أظهرت قياسات الأسي في جميع أنحاء التخمير أن بكتيريا حمض اللاكتيك كانت قادرة على تحمض SVE إلى مستويات أقل من الأسي 4 ، مما يشير إلى التخمير الآمن للاستهلاك. وقد طبقت هذه الطرق على وجه التحديد على الميكروبيوم الملفوف ولكن يمكن أن تكون مفيدة في أنظمة النباتات الأخرى. يمكن أن يكون من الصعب الحفاظ على النظام العقيمة، وبروتوكولات الخطوط العريضة لدينا مفصلة، ولكن وجدنا كل خطوة أن تكون مهمة.