تصنيع أدلة الموجة وضع الصفر لارتفاع تركيز المجهر جزيء واحد

بروتوكول الطباعة الحجرية النانوية المقدم هنا لتصنيع الأدلة الموجية ذات الوضع الصفري هو طريقة يمكن الوصول إليها ومنخفضة التكلفة ولا تتطلب أي أدوات أو مرافق تصنيع متخصصة. ستكون هذه الطريقة مفيدة للفيزياء الحيوية للجزيء الفردي وتسمح لمزيد من الباحثين بإجراء تجارب جزيء واحد بتركيزات ذات صلة بيولوجيا من الكواشف الفلورية. لإنشاء سطح نظيف للترسب التبخيري للجزيئات الغروية ، ضع أغطية زجاج البورسليكات البصرية في الإدخالات المحززة لجرة تلطيخ زجاج كوبلين.

املأ جرة التلوين بما يكفي من الأسيتون لتغطية الغطاء وتغطية البرطمان. قم بتقطيع البرطمان لمدة 10 دقائق عند 40 درجة مئوية. اسكب الأسيتون واشطف الأغطية ثلاث مرات بالماء المقطر.

بعد تكرار الصوتنة والأسيتون ، املأ البرطمان بما يكفي من هيدروكسيد البوتاسيوم لتغطية الغطاء. قم بتقطيع البرطمان مرة أخرى ، مغطى ، لمدة 20 دقيقة عند 40 درجة مئوية. اشطف الأغطية بالماء المقطر ست مرات ، ثم قم بصوتها في الإيثانول لمدة 10 دقائق عند 40 درجة مئوية.

بعد غسل الغطاء ثلاث مرات بالماء المقطر ، التقط برفق كل غطاء على الحافة باستخدام الملقط. جفف كل غطاء بغاز النيتروجين وضع كل غطاء نظيف وجاف وطبق بتري خاص به. جهاز طرد مركزي 50 ميكرولتر من حبات البوليسترين غير الوظيفية ميكرون واحد.

تخلص من المادة الطافية ، مع ترك أقل قدر ممكن من الماء. أعد تعليق الخرزات في 50 ميكرولتر من المذيب ، ثم اخلطها جيدا عن طريق سحب العينات. لإنشاء غرفة رطوبة للترسيب ، رتب ستة أطباق بتري على التوالي.

ضع غطاء واحد في كل طبق بتري واترك الأغطية مفتوحة قليلا مع وضع الغطاء للتعرض للبيئة. ضع مقياس رطوبة ومروحة كهربائية صغيرة خلف أطباق بتري ، ثم سجل الرطوبة النسبية في المختبر. املأ دورق سعة 200 مل ب 150 إلى 200 مل من الماء عند حوالي 75 درجة مئوية وضع الدورق خلف المروحة.

قم بتشغيل المروحة ثم قم بتغطية أطباق Petri والمروحة والدورق ومقياس الرطوبة بحاوية تخزين بلاستيكية شفافة مقلوبة. عندما تصل الرطوبة النسبية إلى 70 إلى 75٪ ، ارفع حاوية التخزين البلاستيكية قليلا وأغلق بسرعة أغطية أطباق بتري لمنع الإفراط في التبول في الأغطية. عندما تصل الرطوبة النسبية في الغرفة إلى 85٪ ماصة خمسة ميكرولترات من تعليق الخرزة في وسط كل غطاء.

قم بتغطية كل طبق بتري مباشرة بعد الترسيب واحتفظ بكل شيء مغطى بحاوية التخزين بين الترسبات. يجب الانتهاء من ترسبات الخرز في أسرع وقت ممكن لتقليل فقدان الرطوبة. إذا كانت الترسبات جافة جدا أو رطبة ، فإن رطوبة الغرفة هي أهم متغير يجب تحسينه.

عند اكتمال جميع الترسبات الستة ، سجل الرطوبة النسبية في الغرفة واترك قطرات الخرز تنتشر وتجف لمدة خمس دقائق. لتوفير سطح درجة حرارة موحدة لتلدين حبات البوليسترين ، ضع لوح ألومنيوم مسطح مطحون فوق لوح تسخين سيراميك قياسي واضبط درجة حرارة اللوح الساخن على 107 درجة مئوية ، درجة حرارة التزجج للبوليسترين. ضع غطاء يحتوي على قالب الخرزة على لوح الألمنيوم الساخن.

بعد تلدينه لمدة 20 ثانية ، قم بإزالة الغطاء من لوح الألمنيوم وضعه على الفور على سطح ألومنيوم بدرجة حرارة الغرفة ليبرد. باستخدام الترسيب التبخيري الحراري ، قم بإيداع 300 نانومتر من النحاس عند أنجستروم في الثانية فوق الغطاء الذي يحتوي على قوالب الخرز. سيؤدي ذلك إلى إنشاء منشورات في الفجوات بين الخرز.

لإزالة النحاس الزائد من الخرز ، اضغط برفق على قطعة من الشريط على السطح ثم انزع الشريط ببطء. قم بإذابة حبات البوليسترين عن طريق وضع الغطاء في التولوين وتركه طوال الليل. التعامل مع الغطاء ينزلق بعناية ، اشطفه مرة واحدة بالكلوروفورم ومرتين بالإيثانول.

جفف القوالب بالنيتروجين. ضعها في منظف بلازما الأكسجين لمدة 30 دقيقة لإزالة البوليمر المتبقي والملوثات. باستخدام الترسيب التبخيري الحراري ، قم بإيداع ثلاثة نانومتر من طبقة التصاق التيتانيوم عند أنجستروم واحد في الثانية ، ثم قم بإيداع 100 إلى 150 نانومتر من الألومنيوم بأربعة أنجستروم في الثانية حول الأعمدة النحاسية وفوقها.

تأكد من أن العينات لا تدور أثناء الترسيب كما يتم تلقائيا في بعض وحدات الترسيب. لإذابة الأعمدة النحاسية ، انقع الغطاء في نقش نحاسي لمدة ساعتين. بعد شطف الأغطية بالماء المقطر ، جففها بالنيتروجين ، ثم قم بتلميع السطح برفق بورق العدسة لكشف أي أعمدة لا تزال مغطاة بالكسوة.

انقع الأغطية في نقش نحاسي لمدة ساعتين أخريين ، ثم اشطفها مرة أخرى بالماء المقطر وجففها بالنيتروجين. بعد تخميل السطح ، يمكن إقران أغطية الدليل الموجي في وضع الصفر بشرائح الكوارتز باستخدام شريط لاصق على الوجهين لعمل غرف تدفق الموائع الدقيقة لتصوير الجزيء الفردي. يعتمد نجاح التجميع الذاتي للقالب الغروي بشكل حاسم على الرطوبة النسبية.

في قالب جيد التكوين ، تكون منطقة الخرز دائرية بحدود محددة بحلقة غير شفافة متعددة الطبقات. في القوالب جيدة التكوين ، يجب أن تحتوي معظم القوالب على حبات سداسية معبأة بشكل وثيق. سيكون هناك بعض العيوب بين الحبوب بسبب التشويش أثناء الترسيب التبخيري.

بعد ترسب النحاس وذوبان حبات البوليسترين ، يجب أن يكون قطر الأعمدة النحاسية أقل من 150 نانومتر. بالنسبة لعمق ترسيب النحاس 300 نانومتر ، يبلغ طول الأعمدة حوالي 250 نانومتر. بعد ترسيب الكسوة المصنوعة من الألومنيوم والذوبان اللاحق للأعمدة النحاسية ، يجب أن تكون الأدلة الموجية مرئية عن طريق الفحص المجهري للقوة الذرية وأن تكون متباعدة حوالي 550 نانومتر.

تلدين قوالب البوليسترين لمدة 20 ثانية إلى إنتاج أدلة موجية من الألومنيوم يبلغ قطرها 118 نانومتر ، وهي صغيرة بما يكفي لقطع انتشار الضوء المرئي. يحتوي المجال النموذجي ل ZMWs للتصوير على 3,000 دليل موجي في مجال رؤية 40 × 80 ميكرون. تم إجراء FRET أحادي الجزيء لاختبار وظيفة ZMW.

كان من الممكن اكتشاف آثار FRET أحادية الجزيء في جميع تركيزات فلورفور Cy5 المحيطة التي تم اختبارها. بالمقارنة ، لن تكون الجزيئات المفردة قابلة للاكتشاف إلا في إضاءة TERF بتركيزات بيكومولار إلى تركيزات نانوية منخفضة. بعد تصنيع الدليل الموجي في وضع الصفر ، يمكن تخميل الأجهزة بالبوليمرات لتقليل التفاعلات غير المحددة أثناء تصوير الجزيء الفردي.

يمكن أيضا حفر القيعان الزجاجية للأدلة الموجية للوضع الصفري قليلا لتعزيز انبعاث الجزيء الفردي. بشكل عام ، ستسمح طريقة تصنيع الدليل الموجي الصفري الجديدة للباحثين بالتحقيق بسهولة أكبر في العمليات الكيميائية الحيوية الديناميكية ، مثل النسخ أو الترجمة بتركيزات ومعدلات أقرب إلى تلك الموجودة في الخلية.