فحص التلألؤ الكهروكيميائي عالي الإنتاجية 7-Plex في وقت واحد لمرض السكري من النوع 1 وأمراض المناعة الذاتية المتعددة
مايو 29, 2020
نحن نصمم اختبار ECL متعدد الإرسال بسيط يجمع بين 7 اختبارات للأجسام المضادة الذاتية معا. الفحص قادر على فحص T1D وأمراض المناعة الذاتية الأخرى المتعددة ، في وقت واحد ، بما في ذلك مرض الاضطرابات الهضمية ، وأمراض الغدة الدرقية المناعية الذاتية ، ومتلازمة المناعة الذاتية متعددة الغدد 1.
يمكن لمقايسة التلألؤ الكهربائي أن يفحص في وقت واحد مرض السكري من النوع 1 وأمراض المناعة الذاتية الأخرى ذات الصلة ، بما في ذلك مرض المناعة الذاتية بالتبريد ومرض الاضطرابات الهضمية ومتلازمة تعدد الغدود المناعية الذاتية -1. يجمع اختبار ECR المعقد للغاية بين ما يصل إلى 10 فحوصات متعددة للأجسام المضادة في بئر واحد ، مما ينتج عنه إنتاجية عالية ، ومكتبات أقل ، ومقايسة أقل تكلفة تتطلب حجما أقل اتساعا. سيتم توضيح الإجراء Xiaofan Jia ، وهو منشور من مختبري.
لتحضير محلول مستضد مختلط مقترن بالرابط ، حدد أولا التركيز الأمثل لكل مستضد ، بناء على مقايسة رقعة الشطرنج ، وقم بتخفيف المستضد المسمى بالبيوتين والروثينيوم إلى تركيز العمل العقلاني. لربط روابط مختلفة بكل من المستضدات الحيوية الفريدة ، لاختبار واحد 96 جيدا ، قم بخلط 240 ميكرولترا من رابط STREPTAVIDIN المترافق المناسب مع 4 ميكرولترات من البروتينات الحيوية ذات الأهمية. ثم أضف 156 ميكرولتر من 1٪ BSA لكل أنبوب واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
في نهاية الحضانة ، أضف 160 ميكرولتر من محلول التوقف إلى كل أنبوب واحتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة إضافية. في نهاية الحضانة ، قم بإزالة 400 ميكرولتر من المستضد المقترن بالرابط من كل أنبوب واسحب جميع معلقات المستضد السبعة في أنبوب واحد. بعد ذلك ، أضف 1.2 مل من محلول التوقف و 4 ميكرولترات من Ru sulfo-NHS المسمى GAD65 و TPO و tTg و ThG وإنترفيرون البروينسولين ألفا ومستضد IA-2 إلى الخليط.
قبل احتضان عينات المصل بخليط المستضد المسمى ، أضف 15 ميكرولترا من المصل لكل بئر من لوحة PCR سعة 96 بئرا ، واخلط 18 ميكرولترا من حمض 0.5 مولار الحمضي مع كل بئر من المصل لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أثناء الحضانة ، أضف 35 ميكرولترا من المستضد و 13 ميكرولترا من محلول Tris المائل لكل بئر من لوحة PCR جديدة مكونة من 96 بئرا. في نهاية الحضانة ، انقل على الفور 25 ميكرولترا من المصل المعالج بالحمض إلى كل بئر من لوحة المستضد.
قم بتغطية اللوحة بورق السقف PCR ، ووضع اللوحة على شاكر بسرعة منخفضة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة ، ضع الطبق على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 18 إلى 24 ساعة. أخرجي الطبق من الثلاجة واتركيه يصل إلى درجة حرارة الغرفة.
ثم أضف 150 ميكرولترا من 3٪ مانع A-buffer إلى كل بئر. عندما تتم معالجة جميع الآبار ، قم بتغطية اللوحة بورق السقف وضع اللوحة في ثلاجة 4 درجات مئوية طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، اقلب الطبق رأسا على عقب ، واغسل العينات ثلاث مرات باستخدام 150 ميكرولتر من PBS-T لكل بئر ، لكل غسلة.
ربتي على اللوحة حتى لا يتبقى أي عازل في أي من الآبار. أضف 30 ميكرولترا من مستضد المصل المحتضن إلى كل بئر. عند إضافة جميع الحاضنات ، قم بتغطية الطبق بورق الألمنيوم وضع الطبق على شاكر بسرعة منخفضة لمدة ساعة واحدة ، في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية الحضانة ، قم بإزالة الحاضنات عن طريق النقر وغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 150 ميكرولتر من PBS-T لكل بئر ، كما هو موضح. بعد الغسيل الأخير ، أضف 150 ميكرولترا من المخزن المؤقت للقراءة إلى كل بئر واقرأ اللوحة على قارئ الألواح ، بالعدد في الثانية. في هذا التحليل لمجموعة كبيرة من العينات من 1026 مريضا بمرض السكري من النوع 1 تم تشخيصهم حديثا ، تمت مقارنة مستويات الأجسام المضادة الذاتية من مقايسة التلألؤ الكهربائي سبعة بالإضافة إلى المستويات من كل اختبار تلألؤ كهربائي واحد تم إنشاؤه ومن كل مقايسة ربط إشعاعي قياسية واحدة وELISA.
كانت خصائص الفحص متطابقة عند النسب المئوية 99 لجميع فحوصات الأجسام المضادة الذاتية ، باستثناء الأجسام المضادة الذاتية للغدة الدرقية ، والتي تم استخدام النسبة المئوية 95 لها. تم العثور على عدد صغير من العينات المتنافرة لكل من الأجسام المضادة التلقائية السبعة حول حدود القطع لكل فحص. هنا ، يمكن ملاحظة البيانات المقابلة ل 1022 عنصر تحكم صحي لكل فحص.
أهم شيء يجب تذكره هو العثور على رابط مختلف لكل من المستضدات الحيوية الفريدة ، وخلط كل مستضد مع خصائص توفير رابط مترافق. ستسمح تقنية الفحص هذه للباحثين بالتخطيط لفحص أمراض المناعة الذاتية المتعددة في وقت واحد في مجموعات سكانية واسعة النطاق وتسمح للعيادات بفحص العديد من الأمراض ذات الصلة بمرض السكري من النوع 1 بسهولة.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة مقايسة كهروكيميائية مضيئة (ECL) متعددة الإرسال تتيح الفحص المتزامن لمرض السكري من النوع الأول ومختلف الأمراض المناعية الذاتية. تجمع هذه المقايسة عدة اختبارات للأجسام المضادة الذاتية في بئر واحد، مما يعزز الكفاءة ويقلل التكاليف.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- المناعة الذاتية
- التشخيص
- مقايسات الوميض الكيميائي الكهربائي
خلفية علمية
- غالبًا ما يرتبط مرض السكري من النوع الأول (T1D) بأمراض مناعية ذاتية أخرى.
- قد تتطلب المقاييس التقليدية إجراء اختبارات متعددة، مما يزيد من الوقت والتكاليف.
- يمكن للمقاييس المتعددة (Multiplexed assays) تبسيط عملية التشخيص.
- يوفر التألق الكيميائي الكهربائي حساسية وخصوصية عاليتين.
الغرض من الدراسة
- تطوير مقايسة ECL متعددة الإرسال لفحص مرض السكري من النوع الأول (T1D) والأمراض المناعية الذاتية ذات الصلة.
- مقارنة أداء المقايسة متعددة الإرسال مع المقايسات الفردية المعتمدة.
- تسهيل عمليات الفحص واسعة النطاق في الإعدادات السريرية.
الطرق المستخدمة
- تحضير محاليل المستضدات المقترنة بالرابط المختلط.
- حضن عينات المصل مع المستضدات الموسومة.
- استخدام تنسيق طبق بـ 96 بئراً للفحص عالي الإنتاجية.
- مقارنة مستويات الأجسام المضادة الذاتية في مرضى السكري من النوع الأول (T1D) والمجموعات الضابطة السليمة.
النتائج الرئيسية
- أظهر المقايسة المتعددة نوعية مماثلة للمقايسات الفردية.
- تم تحديد عدد صغير من العينات المتضاربة بالقرب من عتبات القطع.
- وفرت بيانات لمجموعة كبيرة من مرضى السكري من النوع 1 (T1D) الذين تم تشخيصهم حديثاً.
- مكنت من إجراء فحص فعال لعدة أمراض مناعية ذاتية.
الاستنتاجات
- يعتبر مقايسة ECL المتعددة أداة فعالة للفحص المتزامن.
- يمكن لهذه الطريقة أن تعزز كفاءة التشخيص في الممارسة السريرية.
- يُنصح بإجراء مزيد من التحقق من الصحة على مجموعات سكانية أكبر.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يعالج الكشف المتزامن عن أجسام مضادة ذاتية متعددة في بئر واحدة عنق زجاجة حرج في عمليات الفحص واسعة النطاق للأمراض المناعية الذاتية، مما يقلل من تعقيد المقايسة واستهلاك الموارد. ويعزز نهج التألق الكيميائي الكهربائي متعدد الإرسال الثقة التنبؤية في التشخيص المبكر للمرض من خلال توفير قراءات مرتبطة للمؤشرات الحيوية عبر مرض السكري من النوع 1 والحالات المناعية الذاتية المصاحبة. وتدعم هذه المقايسة عملية فرز المحافظ العلاجية والحد من المخاطر الآلية في تطوير العلاج المناعي من خلال تمكين التصنيف الفعال للمرضى بناءً على ملفات الأجسام المضادة الذاتية المتعددة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال ربط مجموعات الأجسام المضادة الذاتية بالأنماط النهائية للمرض في النماذج قبل السريرية.
- القيمة التشغيلية: تدعم تقليل المخاطر البيولوجية من خلال التحقق الوظيفي من الاستجابات المناعية النوعية للمستضد في الأنظمة ذات الصلة بالمرض.
- القيمة التنبؤية: تعزز الثقة في اختيار الهدف عن طريق تحديد مجموعات فرعية من المرضى الذين لديهم بصمات متقاربة من الأجسام المضادة الذاتية.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تحضير لوحات مؤشرات حيوية كمية وموحدة لحملات الفحص اللاحقة التي تتطلب قابلية تكرار عالية.
- القيمة التشغيلية: توفير جاهزية المقايسة من خلال معقدات (مستضد-رابط) مثبتة تضمن ارتباطاً متسقاً في الطور السائل عبر الآبار.
- القابلية للتوسع: تسهيل إعادة استخدام المنصة لفحص ما يصل إلى 10 أجسام مضادة ذاتية لكل بئر، مما يزيد من إنتاجية الفحص دون الحاجة إلى إعادة التنسيق.
الأبحاث الترجمية وقبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: يتوافق مع الأنظمة ذات الصلة بالمرض من خلال الكشف عن الأجسام المضادة الذاتية المرتبطة بالتطور السريري لمرض السكري من النوع 1 والاضطرابات المناعية الذاتية المصاحبة.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: يدعم قرارات المتابعة أو التوقف من خلال تحديد المرضى الذين لديهم ملفات أجسام مضادة ذاتية عالية النفاذية تتنبأ بالمناعة الذاتية متعددة الأعضاء.
- الحد من مخاطر الآلية: يقلل من الغموض في تفسير الآلية المناعية من خلال القياس المتزامن للأجسام المضادة الذاتية لجزر البنكرياس، والغدة الدرقية، والأمعاء، ومسار الإنترفيرون.
تكامل سير العمل والمسار التحليلي
يعمل هذا المقايسة كجسر يربط بين مرحلة الاكتشاف والمرحلة الانتقالية، مما يتيح التنميط الظاهري المناعي المبكر الذي يوجه مراحل تحديد المركبات الواعدة والتحقق قبل السريري من خلال التوصيف المتعدد للأجسام المضادة الذاتية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال ربط أنماط التعبير المشترك للأجسام المضادة الذاتية بالمسارات الممرضة في نشوء الأمراض المناعية الذاتية.
- الفرز: تقدم مخرجات كمية وقابلة للتكرار تتيح مقارنة الاستجابات المناعية عبر ظروف علاجية أو خلفيات جينية مختلفة.
- التحليلات: توفر قراءات معيارية لعدد العدات في الثانية تتيح المقارنة الإحصائية لمستويات الأجسام المضادة الذاتية بين مجموعات المرضى ومجموعات الضبط.
- الأبحاث الترجمية: ترتبط بالاستمرارية قبل السريرية من خلال التحقق من صحة لوحات المؤشرات الحيوية في العينات البشرية التي تعكس الخلل المناعي المرتبط بالمرض.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة مقايسة مناعية قابلة لإعادة الاستخدام يمكن تكييفها مع لوحات أمراض مناعية ذاتية أو التهابية أخرى تتجاوز تكوين الـ 7-plex الأولي.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من صحة الهدف عن طريق تقليل السلبيات الكاذبة من خلال القياس المتزامن للأجسام المضادة الذاتية.
- القيمة التشغيلية: تعزز التقييس وقابلية التكرار عن طريق القضاء على التباين بين الآبار من خلال تقديم المستضد المثبت.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن كفاءة رأس المال من خلال دمج سبعة اختبارات تشخيصية في خطوة واحدة من سير العمل.
- تأثير المحفظة: تتيح تحديد الأولويات للمرشحين العلاجيين وفقاً للمخاطر المعدلة بناءً على مجموعات المرضى المحددة بالمؤشرات الحيوية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تصميم المقاييس المناعية وكيمياء الروابط المستخدمة في تثبيت المستضدات.
- يعتمد على وجود قارئ أطباق قادر على الكشف عن التألق الكهرومغناطيسي بتنسيق 96 بئراً.
- يستلزم توحيد بروتوكولات الحجب والغسيل عبر جميع المواقع في الدراسات متعددة المراكز.
- يتطلب تكييف تركيزات المستضدات عند التوسع في استهداف أجسام مضادة ذاتية جديدة تتجاوز الأهداف السبعة الأصلية.
- محدود بالحاجة إلى تحسين أزواج الروابط والمستضدات لمنع التفاعل المتقاطع في التنسيق متعدد الإرسال.
