Name: إعداد مقتطفات الخلية من قبل Cryogrinding في مطحنة التجميد الآلي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min
Description: اكتشف طريقة الطحن البارد لتحضير مستخلصات الخلايا الكاملة من الخميرة مع الحفاظ على سلامة البروتين. تُحسّن هذه التقنية استخلاص الجزيئات الكبيرة الوظيفية للدراسات البروتينية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يتم دعم الأبحاث في مختبر غونجان بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة والمؤسسة الوطنية للعلوم ووزارة الصحة في فلوريدا. نشكر الطالب الجامعي جون باركر على المساعدة التقنية.

1. إعداد الفشار الخميرة
<ol><li>تنمو خلايا الخميرة في 0.5 لتر من وسائط YPD إلى كثافة 1 × 107 خلايا / مل. عد الخلايا باستخدام كاونتر أو أي وسيلة أخرى.</li>
	<li>خلايا الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 2400 غرام و 4 درجة مئوية.</li>
	<li>غسل كل عينة مرة واحدة مع 500 مل من الجليد الباردة deionized 18 ميجا أوم ميلي Q المياه.</li>
	<li>الكريات ريسوسيبند في 15 مل من الجليد الباردة Lysis العازلة [20 mM HEPES-KOH pH 7.5، 110 mM KCl، 0.1٪ توين، 10٪ الجلسرين، مع عامل خفض المضافة حديثا 10 mM β-mercaptoethanol، كوكتيل مثبطات البروتياز، مثبطات 10 ميكرومتر بروتياسوم MG-132، 1 mM deacetylase مثبطات الصوديوم ومثبطات فوسفاتاز (1 mM الصوديوم فاناداتي، 50 mM فلوريد الصوديوم، 50 mM الصوديوم β-الجليسيروفوفات)]. راجع جدول المواد لمزيد من التفاصيل. إبقاء الخلايا resuspended على الجليد حتى العينات جاهزة للخطوة التالية. ملاحظة: يمكن استخدام مجموعة واسعة من مخازن التحلل التي تحتوي على عدد من المنظفات غير الأيونية مع العينات والمثبطات المحددة المدرجة فيه على أساس تطبيق المصب. إن إدراج مثبطات البروتياز والبروتياسومية أمر بالغ الأهمية لمنع تدهور البروتين، خاصة عندما تذوب المستخلصات.</li>
	<li>جعل المفاجئة المجمدة الخميرة الفشار عن طريق إضافة ببطء تعليق الخلية قطرة واحدة في وقت واحد باستخدام ماصة ما قبل المبردة المصلية في واحد أو أكثر من أنابيب الطرد المركزي 50 مل أبقى على الجليد الجاف ومليئة LN2 حتى أسفل الحافة. أعلى حتى النيتروجين السائل في الأنبوب في كثير من الأحيان للتعويض عن خسارته بسبب التبخر السريع. العمل في منطقة جيدة التهوية لتجنب المخاطر المرتبطة باختناق النيتروجين.<ol>
<li>بدلا من أنبوب 50 مل، واستخدام أنابيب متعددة 50 مل تعادل معا (أو أي حاوية مع فم كبير، مثل زجاجة كبيرة من البلاستيك الطرد المركزي التي يمكن أن تتسامح مع درجات الحرارة المبردة) لإعداد الذرة البوب(الشكل 1A). أكبر الحاوية وفتحها، وأسهل هو إعداد الفشار لأن هذا يمنع تكتل الفشار لتشكيل مجاميع كبيرة. مجموعة حجم 0.3-0.5 سم للشارخ مثالية لتحقيق السليم طحن / الطحن باستخدام مطحنة الفريزر (الشكل 1B).</li>
		<li>تأكد من أن LN2 قد تبخرت تماما من الأنابيب التي تحتوي على الفشار قبل تخزينها في -80 درجة مئوية. فمن الممكن أن تتوقف بعد إعداد الفشار الخميرة كما أنها مستقرة لعدة سنوات عندما أبقى في -80 درجة مئوية.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61164/61164fig01.jpg"> الشكل 1: إعداد الفشار الخميرة. (أ) الخميرة "الفشار" هو الذي أدلى به من خلال تجميد dropwise من تعليق الخلية في LN2. نستخدم 1-3 أنابيب 50 مل عقد جنبا إلى جنب مع شريط مطاطي ووضعها في دلو الجليد مليئة الجليد الجاف. تمتلئ الأنابيب مع LN2 حتى أقل بقليل من الحافات وتصدرت مع النيتروجين السائل في كثير من الأحيان للحفاظ عليها كامل تقريبا حتى تم إجراء كل تعليق الخلية في الفشار (B) حجم الفشار هو عامل مهم من كفاءة طحن الأمثل. يجب أن يتراوح حجم الفشار بين 0.3 و 0.5 سم في القطر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61164/61164fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
2- الكريوغريند
<ol><li>للبدء، تأكد من أن هناك ما يكفي من LN2 المتاحة للاسترخاء مطحنة الفريزر، طحن قوارير، والإمدادات وتشغيل الجهاز لجميع العينات. وينبغي أن تكفي 30-35 لتراً من LN2 لأقل من خمس عينات. املأ غرفة مطحنة الفريزر مع LN2 حتى خط التعبئة. تحذير:يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات التي تنطوي على LN2 في منطقة جيدة التهوية وطاحونة الفريزر نفسها يجب أن تكون موجودة في مثل هذه المنطقة لتجنب خطر الاختناق. ارتداء معدات الحماية الشخصية بما في ذلك الأحذية المناسبة، ومعطف المختبر، ونظارات السلامة، وطبقة قاعدة من قفازات النيتريل، ثم القفازات الحرارية، تليها زوج آخر من قفازات نيتريل. استخدام أقصى درجات الحذر عند التعامل مع LN2.</li>
	<li>أغلق غطاء مطحنة الفريزر ببطء، وتجنب رشة LN2 واسمح لبضع دقائق للآلة أن تبرد. قد يكون من الضروري إعادة ملء الغرفة بـLN 2 للتعويض عن الخسارة الناجمة عن التبخر قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. ملاحظة: إعادة تعبئة LN2 حسب الحاجة فقط حتى خط التعبئة. لا املأ الغرفة لأن هذا يمكن أن يكون خطرا وضارة على حد سواء إلى الجهاز. تتوفر أنظمة إعادة التعبئة الآلية لمطحنة التجميد التي يمكنها تجديد LN2 المتبخرة حسب الحاجة مباشرة من خزان تخزين متصل بمطحن التجميد.</li>
	<li>قبل قشعريرة قوارير طحن كبيرة وشريط المؤثر المغناطيسي عن طريق الغمر لهم في LN2 أبقى في ديوار صغيرة منفصلة. Decant كل LN2 عندما توقف LN2 محتدما. ثم إضافة الفشار عينة / الخميرة إلى قارورة طحن وختم بإحكام مع اثنين من المقابس نهاية الفولاذ المقاوم للصدأ.<ol>
<li>لا تملأ أكثر من ثلث قارورة طحن مع العينة كما أن ذلك يمكن أن يقلل من كفاءة طحن. بدلاً من ذلك، يمكن معالجة عينات أكبر بتقسيمها إلى قاريتين أو أكثر وطحنها بشكل متسلسل. يمكن استخدام قارورة طحن أصغر لعينات أصغر (حتى 3 مل).</li>
	</ol></li>
	<li>ضع قارورة الطحن في غرفة مطحنة الفريزر وأقفلها في مكانها. أغلق الغطاء.</li>
	<li>بالنسبة إلى الخميرة الناشئة، طحن العينات لما مجموعه ثلاث دورات لمدة 2 دقيقة/دورة (مع 2 دقيقة من الراحة للتبريد بين الدورات) بمعدل ساحق قدره 14. عندما يتوقف الجهاز بعد الانتهاء من الدورات، فتح غطاء مطحنة الفريزر ببطء وبعناية فتح القارورة مع خلية مسحوق المجمدة lysate وإزالتها من مطحنة الفريزر. إذا تم استخدام قارورة صغيرة متعددة، والعمل بسرعة لإزالة قارورة واحدة في وقت واحد ووضعها في الجليد الجاف. ملاحظة: عادة ما لا تكون هناك حاجة لضبط المعلمات طحن عند استخدام قوارير من أحجام مختلفة مع نفس النوع من العينة. ومع ذلك ، فإن المعلمات طحن مثل عدد الدورات ومعدل طحن تحتاج إلى أن تكون محددة تجريبيا لأنواع مختلفة من العينات ، اعتمادا على السهولة التي lyse. معظم خلايا الثدييات والأنسجة الرخوة سوف ينعم في 1-2 دورات بمعدل ساحق من 10. من الصعب أن عينات مثل البكتيريا والخميرة ويرقات الذباب تطير وذباب الفاكهة الكبار تتطلب 3-6 دورات في المعدل الأقصى ، في حين أن الأنسجة الصلبة مثل العظام والأسنان ، وما إلى ذلك قد تتطلب ما يصل إلى 10 دورات. يمكن رؤية aliquot صغيرة من العينة المذابة تحت المجهر قبل وبعد الطحن لحساب عدد الخلايا السليمة وغير المُهدَّبة لتحديد كفاءة التحلل. وقد نشرت في السابق تحليل ممتاز لتأثير المعلمات cryogrinding على الإفراج عن البروتينات والحمض النووي من الخميرة في مهدها15.</li>
	<li>تعمل بسرعة حتى لا تسمح للعينة أن تذوب ، فك بعناية واحدة من القطع النهائية (اختيار واحد يبدو أنه أصبح فضفاضة إلى حد ما خلال طحن) باستخدام أداة الافتتاح. ثم، استخدم زوج من ملقط طويلة (التي هي مبردة مسبقا في دلو مع الثلج الجاف) لإزالة شريط الأثر. جمع العينة المسحوقة عن طريق عكس والاستفادة من القارورة طحن على البوليسترين وزنها طبق مبردة مسبقا مع LN2 وأبقى على الجليد الجاف.</li>
	<li>مرة واحدة وقد تم استرداد كل من lysate خلية المجمدة مسحوق من قارورة طحن، صب مساحيق من طبق وزنها مرة أخرى إلى أنبوب 50 مل والمضي قدما على الفور إلى خطوة ذوبان بطيئة وصفها بعد ذلك للحصول على أفضل النتائج. بدلا من ذلك، تخزين مسحوق المجمدة lysate بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية، على الرغم من أن هذا قد يؤدي إلى بعض التدهور.</li>
	<li>إعداد دلو الثلج مع الطين 50٪ من الجليد والماء ووضعها على لوحة ضجة مع محرك المغناطيسي. غمر رف سلك أو رف آخر مناسب في الطين الجليدي لعقد العينات.<ol>
<li>ثم، ذوبان العينات ببطء على حمام الطين الجليد مع التحريض المستمر من الطين باستخدام مُحرك مغناطيسي. إضافة المزيد من الثلج لتحل محل ذوبان الجليد (قد تحتاج بعض المياه إلى التخلص منها لمنع دلو الثلج من الفيض). منذ العديد من مثبطات قصيرة نصف حياة في المخازن المؤقتة مائي، إضافة كوكتيل مثبطات البروتياز إضافية (انظر جدول المواد)و 10 μM مثبطات بروتيام MG-132 إلى lysate مرة واحدة تبدأ العينات ذوبان الجليد (بعد حوالي 30 دقيقة).</li>
		<li>إزالة الجليد التي تشكلت على السطح الخارجي للأنابيب كل 5 دقائق لتسريع عملية الذوبان. لاحظ أن الذوبان السريع للعينات في درجة حرارة الغرفة أو أعلى يمكن أن يؤدي إلى تدهور كبير.</li>
	</ol></li>
	<li>بعد أن تذوب العينات تماما (قد يستغرق أكثر من ساعة اعتمادا على كمية العينة)، والطرد المركزي في 3220 ~ غرام لمدة 20 دقيقة في جهاز طرد مركزي مُبرد على 4 درجة مئوية لإزالة الجزء الأكبر من حطام الخلية من اللوى.</li>
	<li>نقل فائقة إلى 50 مل أنابيب الطرد المركزي البولي التي تم تبريدها مسبقا على الجليد والطرد المركزي العينات في 16000 غرام لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية (انظر جدول المواد).</li>
	<li>نقل فقط supernatant واضحة تتكون من استخراج الخلية كاملة أوضح من وسط العمود السائل في أنبوب ببطء شديد وبعناية، دون إزعاج طبقة الدهون غائم (الشكل 2)، في أنبوب 15 مل المبردة باستخدام ماصات ما قبل المبردة المصلية. تجنب إزالة كل من lysate في أنبوب الطرد المركزي لمنع ترحيل الدهون والحطام. يمكن طرد بقايا الأنبوب في جهاز الطرد المركزي عدة مرات لاستعادة كميات صغيرة من استخراج بعد كل تدور. ملاحظة: الدهون جنبا إلى جنب مع أي البروتينات المشوهة تظهر غائم / حليبي وتقع في الجزء العلوي من واجهة السائل / الهواء، وأحيانا فوق بيليه نفسها التي تتكون من الحطام الخلوي غير قابلة للذوبان(الشكل 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61164/61164fig02.jpg"> الشكل 2: استخراج طبقات في أنبوب الطرد المركزي. يشار إلى السمات الرئيسية المرئية لاستخراج الخلية بأكملها في أنبوب بعد الطرد المركزي في 16،000 غرام لمدة 20 دقيقة. تعتمد الوفرة النسبية لكل ميزة على نوع العينة ، ومرحلة نمو الخلايا (الأسية مقابل الثابتة) ، ومقدار العازلة التحلل المستخدمة في خلايا إعادة الإنفاق وكفاءة التحلل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61164/61164fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<ol start="12"><li>الطرد المركزي أي lysate المتبقية لمدة 5 دقائق لاسترداد المزيد من استخراج. كرر هذا 5 دقيقة الطرد المركزي عدة مرات إذا لزم الأمر لاسترداد أكبر قدر من استخراج واضحة قدر الإمكان. تجاهل lysate غائما تحتوي على الدهون على مقربة من الجزء السفلي من أنبوب بالقرب من بيليه.</li>
	<li>استخدم هذه المقتطفات لتطبيقات المصب مثل تنقية البروتين المعقدة، والمناعة، وتحليل البروتيوم.</li>
</ol>

<ol><li>Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).</li>
<li>Dunn, B., Wobbe, C. R. Preparation of protein extracts from yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDunn%2C+B+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , Chapter 13, Unit 13 (2001).</li>
<li>Holm, C., Meeks-Wagner, D. W., Fangman, W. L., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+efficient+method+for+isolating+DNA+from+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A rapid, efficient method for isolating DNA from yeast.</a> Gene. 42 (2), 169-173 (1986).</li>
<li>Nandakumar, M. P., Marten, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lysis+methods+and+preparation+protocols+for+one-+and+two-dimensional+electrophoresis+of+Aspergillus+oryzae+intracellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Comparison of lysis methods and preparation protocols for one- and two-dimensional electrophoresis of Aspergillus oryzae intracellular proteins.</a> Electrophoresis. 23 (14), 2216-2222 (2002).</li>
<li>Silva, G. A. D., Bernardi, T. L., Schaker, P. D. C., Menegotto, M., Valente, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+yeast+DNA+extraction+by+boiling+and+freeze-thawing+without+using+chemical+reagents+and+DNA+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Archives+of+Biology+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Rapid yeast DNA extraction by boiling and freeze-thawing without using chemical reagents and DNA purification.</a> Brazilian Archives of Biology and Technology. 55, 319-327 (2012).</li>
<li>Baldwin, C., Robinson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Saccharomyces+cerevisiae+using+enzymatic+lysis+combined+with+high-pressure+homogenization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Techniques%22%5BJournal%5D)">Disruption of Saccharomyces cerevisiae using enzymatic lysis combined with high-pressure homogenization.</a> Biotechnology Techniques. 4 (5), 329-334 (1990).</li>
<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
<li>Hudspeth, M. E., Shumard, D. S., Tatti, K. M., Grossman, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+yeast+mitochondrial+DNA+in+high+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of yeast mitochondrial DNA in high yield.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 610 (2), 221-228 (1980).</li>
<li>Szymanski, E. P., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+yeast+protein+extraction+and+purification+for+the+study+of+function%2C+interactions%2C+and+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50921(2013).</li>
<li>Bzducha-Wróbel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+efficiency+of+different+disruption+methods+on+yeast+cell+wall+preparation+for+%CE%B2-glucan+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the efficiency of different disruption methods on yeast cell wall preparation for β-glucan isolation.</a> Molecules. 19 (12), 20941-20961 (2014).</li>
<li>Umen, J. G., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+a+U5+snRNP+protein+in+3%27+splice+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection.</a> Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).</li>
<li>Smith, B. C., Fisher, D. L., Weedn, V. W., Warnock, G. R., Holland, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+the+sampling+of+dental+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forensic+Sciences%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to the sampling of dental DNA.</a> Journal of Forensic Sciences. 38 (5), 1194-1209 (1993).</li>
<li>Sweet, D., Hildebrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+DNA+from+human+teeth+by+cryogenic+grinding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forensic+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recovery of DNA from human teeth by cryogenic grinding.</a> Journal of Forensic Sciences. 43 (6), 1199-1202 (1998).</li>
<li>Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Dean, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+RNA+isolation+from+loblolly+pine+%28P.+taeda+L.%29+and+other+conifer+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An improved method of RNA isolation from loblolly pine (P. taeda L.) and other conifer species.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), e1751(2010).</li>
<li>Singh, M. R., Roy, S., Bellare, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Cryogenic+Grinding+on+Release+of+Protein+and+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Engineering%22%5BJournal%5D)">Influence of Cryogenic Grinding on Release of Protein and DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> International Journal of Food Engineering. 5 (1), (2009).</li>
<li>Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Paik, J., Gunjan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+levels+are+regulated+by+phosphorylation+and+ubiquitylation-dependent+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Histone levels are regulated by phosphorylation and ubiquitylation-dependent proteolysis.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 925-933 (2009).</li>
<li>Liang, D., Burkhart, S. L., Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+dosage+regulates+DNA+damage+sensitivity+in+a+checkpoint-independent+manner+by+the+homologous+recombination+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Histone dosage regulates DNA damage sensitivity in a checkpoint-independent manner by the homologous recombination pathway.</a> Nucleic Acids Research. 40 (19), 9604-9620 (2012).</li>
<li>Singh, R. K., Gonzalez, M., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+E3+ubiquitin+ligases+that+regulate+histone+protein+levels+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Novel E3 ubiquitin ligases that regulate histone protein levels in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 7 (5), 36295(2012).</li>
<li>Gunjan, A., Verreault, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rad53+kinase-dependent+surveillance+mechanism+that+regulates+histone+protein+levels+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Rad53 kinase-dependent surveillance mechanism that regulates histone protein levels in S. cerevisiae.</a> Cell. 115 (5), 537-549 (2003).</li>
<li>Gill, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+remains+of+the+Romanov+family+by+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis.</a> Nature Genetics. 6 (2), 130-135 (1994).</li>
<li>Alain, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extractions+from+deep+subseafloor+sediments%3A+novel+cryogenic-mill-based+procedure+and+comparison+to+existing+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">DNA extractions from deep subseafloor sediments: novel cryogenic-mill-based procedure and comparison to existing protocols.</a> Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 355-362 (2011).</li>
<li>Mohammad, F., Buskirk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+Ribosome+Profiling+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Protocol for Ribosome Profiling in Bacteria.</a> Bio-Protocol. 9 (24), 3468(2019).</li>
<li>Liew, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+microRNAs+in+the+coral+Stylophora+pistillata%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of microRNAs in the coral Stylophora pistillata.</a> PLoS One. 9 (3), 91101(2014).</li>
<li>Lopez de Heredia, M., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+integrity+as+a+quality+indicator+during+the+first+steps+of+RNP+purifications%3A+a+comparison+of+yeast+lysis+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochem%22%5BJournal%5D)">RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications: a comparison of yeast lysis methods.</a> BMC Biochem. 5 (14), (2004).</li>
<li>Grant, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+plant+cell+walls+with+adsorbed+polyphenols+alter+porcine+faecal+bacterial+communities+during+in+vitro+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Purified plant cell walls with adsorbed polyphenols alter porcine faecal bacterial communities during in vitro fermentation.</a> Food & Function. 11 (1), 834-845 (2020).</li>
<li>Lolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryogenic+grinding+pre-treatment+improves+extraction+efficiency+of+fluoroquinolones+for+HPLC-MS%2FMS+determination+in+animal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cryogenic grinding pre-treatment improves extraction efficiency of fluoroquinolones for HPLC-MS/MS determination in animal tissue.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (5), 1933-1937 (2007).</li>
<li>Santos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Cd+and+Pb+in+food+slurries+by+GFAAS+using+cryogenic+grinding+for+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of Cd and Pb in food slurries by GFAAS using cryogenic grinding for sample preparation.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (3), 183-189 (2002).</li>
<li>da Silva, E. G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+method+for+the+determination+of+copper%2C+manganese+and+iron+in+seafood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Composition+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">Fast method for the determination of copper, manganese and iron in seafood samples.</a> Journal of Food Composition and Analysis. 21 (3), 259-263 (2008).</li>
<li>Kamogawa, M. Y., Nogueira, A. R. A., Costa, L. M., Garcia, E. E., Nobrega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+preparation+of+hair+slurries+using+cryogenic+grinding+and+water-soluble+tertiary-amines+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Spectrochimica+Acta+Part+B-Atomic+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">A new strategy for preparation of hair slurries using cryogenic grinding and water-soluble tertiary-amines medium.</a> Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy. 56 (10), 1973-1980 (2001).</li>
<li>Sillen, A., Hall, G., Richardson, S., Armstrong, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sr-87%2FSr-86+ratios+in+modern+and+fossil+food-webs+of+the+Sterkfontein+Valley%3A+Implications+for+early+hominid+habitat+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Geochimica+Et+Cosmochimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Sr-87/Sr-86 ratios in modern and fossil food-webs of the Sterkfontein Valley: Implications for early hominid habitat preference.</a> Geochimica Et Cosmochimica Acta. 62 (14), 2463-2473 (1998).</li>
<li>Nielsen-Marsh, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+preservation+of+osteocalcin+protein+and+mitochondrial+DNA+in+bison+bones+older+than+55+ka%5BTitle%5D)+AND+%22Geology%22%5BJournal%5D)">Sequence preservation of osteocalcin protein and mitochondrial DNA in bison bones older than 55 ka.</a> Geology. 30 (12), 1099-1102 (2002).</li>
</ol>

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

وهناك قيد من دراسة البروتينات المحلية من الخميرة هو تحلل غير فعال من خلايا الخميرة بسبب جدار الخلايا صعبة. على الرغم من أن عدة طرق قد وضعت، الأسلوب الأكثر اتساقا وكفاءة في أيدينا هو cryogrinding من خلايا الخميرة فلاش المجمدة كما الفشار. هذه الطريقة تسمح لإعداد موثوق من مقتطفات الخلية كاملة عالية الجودة من الخميرة في مهدها مقارنة مع أساليب تحلل أخرى. وأظهرت النتائج التمثيلية أن cryogrinding متفوقة على طريقة ميكانيكية شعبية لتحلل الخميرة التي توظف طحن الخرز في 4 درجة مئوية(الشكل 3A و 3...

الخميرة هي كائن نموذجي شعبي لدراسات البروتين ، كما هو كائن حي بسيط eukaryotic مع وفرة من الأدوات الوراثية والكيميائية الحيوية المتاحة للباحثين1. بسبب جدار الخلية قوي، أحد التحديات التي يواجهها الباحثون هو في lysing بكفاءة الخلايا دون الإضرار محتويات الخلوية. تتوفر طرق مختلفة للحصول على مستخلصات البروتين من خلال تعطيل خلايا الخميرة التي تشمل تحلل انزيمي (zymolyase)2،3، تحلل كيميائي4، تحلل طبيعي عن طريق التجميد ذوبان5، الضغط القائم على (الصحافة الفرنسية)6،7، الميكانيكية (الخرز الزجاجي ، طاحونة القهوة)8،9،10 و 10 ، و11 . يمكن أن تختلف كفاءة تحلل الخلايا وغلة البروتين بشكل كبير اعتمادًا على التقنية المستخدمة ، مما يؤثر على النتيجة النهائية أو ملاءمة التطبيق المطلوب للمصب للlysate. عند دراسة البروتينات غير المستقرة، لديها تعديلات عابرة بعد التراتف، أو حساسة لدرجة الحرارة، من المهم بشكل خاص استخدام طريقة من شأنها تقليل فقدان العينة أو تدهور أثناء التحضير.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>استخراج تقنية إعداد</td>
			<td>التفاصيل</td>
			<td>مزايا</td>
			<td>عيوب</td>
			<td>تحليل المصب</td>
			<td>مرجع</td>
		</tr><tr><td>الصحافة الفرنسية: التجانس عالي الضغط (الملقب Microfluidizer) مع المعالجة المسبقة الأنزيمية باستخدام Zymolyase</td>
			<td>Zymolyase-20T، وهو التجانس Microfluidizer الضغط العالي. ويتكون المعرقل من مضخة ذات ضغط عال تحركها الهواء (نسبة 1:250؛ ضغط الهواء المطلوب 0.6-l-MPa) وغرفة تعطيل خاصة مع وحدة ضغط الظهر إضافية. مطلوب عينة حجم الحد الأدنى من 20 مل للمعالجة.</td>
			<td>التعطيل النهائي الكلي الذي تم الحصول عليه باستخدام البروتوكول المشترك اقترب من 100٪ مع 4 تمريرات بضغط 95 MPa ، مقارنة فقط بـ 32 ٪ من التعطيل مع 4 تمريرات في 95 MPa باستخدام التجانس فقط بدون Zymolyase.</td>
			<td>غير مناسب للتطبيقات الصغيرة الحجم. يمكن الحصول على الإنزيمات باهظة الثمن للمستحضرات على نطاق واسع.</td>
			<td>تنقية البروتين</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>مضرب الخرز: الخلايا المعالجة Zymolyase مع حبات زجاجية في أداة fastprep</td>
			<td>تقريبا يتم إضافة حجم متساو من الباردة والجافة، وحمض غسلها حبات الزجاج 0.5 ملم إلى حجم معين من بيليه الخلية في العازلة تحلل وتعطلت الخلايا عن طريق التحريض اليدوي قوية.</td>
			<td>ومن المفيد بشكل خاص عند صنع مقتطفات من العديد من الثقافات الخميرة الصغيرة المختلفة لأغراض فحص بدلا من تنقية البروتين.</td>
			<td>خلال إجراء حبة الزجاج، يتم التعامل مع البروتينات بقسوة مما تسبب في رغوة واسعة النطاق مما يؤدي إلى denaturation البروتين. كمية من كسر الخلية تختلف, في حين أن تحلل البروتين وكذلك قد تنتج عن تعديل البروتينات من تسخين استخراج فوق 4 درجة مئوية أثناء الكسر الميكانيكية.</td>
			<td>في الغالب الحمض النووي وتحاليل الحمض النووي الريبي، ولكن أيضا تحليل البروتين عن طريق denaturing electropheoresis هلام، إما مع أو بدون النشاف الغربية.</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>علاج Zymolyase تليها تحلل باستخدام مزيج من الصدمة التناضحة والتجانس دونيس</td>
			<td>بعد الهضم الأنزيمي من جدران الخلايا، يتم lysed رأب البلاست مع 15 إلى 20 السكتات الدماغية من الحشرات ضيق المناسب (إزالة 1 إلى 3 ميكرومتر) في التجانس Dounce.</td>
			<td>مفيد لاستخدام سلالات protease ناقصة مثل BJ926 أو EJ101. هذه هي ألطف طريقة لكسر خلايا الخميرة وبالتالي هو الأكثر ملاءمة لإعداد مقتطفات التي يمكن أن تقوم بوظائف الأنزيمية المعقدة (على سبيل المثال، الترجمة، النسخ، النسخ المتماثل الحمض النووي) والتي سلامة الهياكل الجزيئية (على سبيل المثال، الريبوسومات، لصقات) يجب الحفاظ عليها. ومن المفيد أيضا لعزل النوى سليمة التي يمكن استخدامها لدراسات الكروماتين (بلوم والكربون، 1982) أو لاستخراج البروتين النووي (لو وكورنبرغ، 1987).</td>
			<td>العيوب الرئيسية لإجراء تجميل اللواء هي أنها مملة نسبيا ومكلفة، وخاصة بالنسبة للمستحضرات على نطاق واسع (>10 لتر)، وفترات الحضانة الطويلة يمكن أن تؤدي إلى تحلل البروتين أو تعديل البروتين.  بالنسبة لمستحضرات الكروماتين ، يبدو أنها ذات جودة متفاوتة أو أقل من تلك التي تنتجها التفاضلية الطرد المركزي (على أساس سلامة سلم النيوكلوزومات).</td>
			<td>عزل نوى سليمة لدراسات الكروماتين، مقتطفات التي يمكن أن تقوم بها وظائف الأنزيمية المعقدة، مقتطفات تتطلب سلامة هياكل الجزيئات، مستخلصات البروتين النووي.</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>تعطيل الخلية من الخلايا المجمدة فلاش عن طريق طحن في النيتروجين السائل باستخدام هاون / الحشرات أو خلاط</td>
			<td>يتم تجميد الخلايا على الفور في النيتروجين السائل ثم طحنها يدويا في هاون باستخدام الحشرات، أو باستخدام خلاط وارينغ في وجود النيتروجين السائل.</td>
			<td>البروتوكول سريع وسهل. ويمكن أن تستوعب كميات مختلفة من خلايا الخميرة بما في ذلك الثقافات الكبيرة جدا. وتتمثل ميزتها الرئيسية في أن الخلايا تؤخذ مباشرة من الحالة المتنامية بنشاط إلى النيتروجين السائل (−196 درجة مئوية)، مما يقلل من أنشطة الإنزيمات التحللية مثل البروتياسات والنوى وكذلك الأنشطة التي تعدل البروتينات (مثل الفوشطات وال كيناس). وهي مناسبة بشكل خاص لصنع مستخلصات الخلية الكاملة من ثقافة خميرة واحدة لتنقية البروتين على نطاق واسع.</td>
			<td>فوضوي بعض الشيء ويحتمل أن يكون خطيرا على المحقق الإهمال. عينات صغيرة (أي، 10-إلى 100-مل الثقافات الخميرة) لا تتم معالجتها بسهولة لأنه لا توجد كتلة كافية من كتل الخلايا المجمدة لكسر فعال في الخلاط. ومن تستغرق وقتا طويلا لمعالجة عينات فردية وتنظيف المعدات بين الاستخدامات.</td>
			<td>مقتطفات الخلية الكاملة من ثقافة الخميرة واحدة لتنقية البروتين على نطاق واسع.</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>التحلل التلقائي، مطحنة الخرز</td>
			<td>درجة حُكّة 5.0، 50 درجة مئوية، 24 ساعة، 200 دورة في الدقيقة / Ø 0.5 مم، 5 × 3 دقائق/3 دقيقة</td>
			<td>سريعة وفعالة تحلل، وخاصة بالنسبة لإعداد استخراج على نطاق صغير</td>
			<td>يؤدي توليد الحرارة إلى التآكل وتدهور الجزيئات الجزيئات. معدات الضرب حبة المطلوبة.</td>
			<td>تحليلات صغيرة الحجم.</td>
			<td rowspan="2">10</td>
		</tr><tr><td>التحلل التلقائي، سونيكيشن</td>
			<td>درجة الحرارة 5.0، 50 درجة مئوية، 24 ساعة، 200 دورة في الدقيقة، 4 × 5 دقيقة/2 دقيقة، نبض 80٪، قوة 80٪</td>
			<td>معدات سونيكيشن عادة ما تكون متاحة في معظم المؤسسات.</td>
			<td>يؤدي توليد الحرارة إلى التآكل وتدهور الجزيئات الجزيئات. معدات سونيكيشن المطلوبة. يمكن أن يستغرق التحلل البطيء أكثر من 24 ساعة.</td>
			<td>الخميرة خلية الجدار الاستعدادات.</td>
		</tr><tr><td>عملية الغليان والتجميد</td>
			<td>لا توجد معدات متخصصة تحتاج سوى الفريزر القياسية وكتلة التدفئة أو حمام الماء الساخن.</td>
			<td>كفاءة، قابلة للاستنساخ، بسيطة وغير مكلفة.</td>
			<td>يؤدي توليد الحرارة إلى التآكل وتدهور الجزيئات الجزيئات.</td>
			<td>تحليل الحمض النووي من قبل PCR.</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 1: مقارنة الأساليب المتاحة لإعداد مستخلصات الخميرة.
يستخدم التبريد (الملقب طحن المبردة / طحن المبردة) عادة لاسترداد الأحماض النووية والبروتينات أو المواد الكيميائية من عينات حساسة لدرجة الحرارة بطريقة موثوقة للتحليلات الكمية أو النوعية. وقد تم استخدامه بنجاح لتطبيقات متعددة في مجالات متنوعة بما في ذلك التكنولوجيا الحيوية، وعلم السموم، وعلم الطب الشرعي12،13، والعلوم البيئية، والبيولوجيا النباتية14 وعلوم الغذاء. عادة ما تعتمد عزل الجزيئات الحيوية البيولوجية السليمة بشكل حاسم على درجة الحرارة. تضمن درجات الحرارة المنخفضة للغاية بقاء البروتياز والنيات غير نشطة ، مما يؤدي إلى عزل موثوق به للبروتينات والأحماض النووية والجزيئات الأخرى للتحليلات اللاحقة. في الواقع، يحافظ مطحنة الفريزر عادة على درجة حرارة العينة من -196 درجة مئوية (نقطة غليان LN2)، وبالتالي تقليل الحمض النووي/الحمض النووي الريبي أو التآكل البروتيني والتحلل.
طاحونة الفريزر توظف غرفة طحن الكهرومغناطيسية التي تتحرك بسرعة شريط معدني صلب أو اسطوانة ذهابا وإيابا داخل قارورة تحتوي على عينة ليتم سحقها بين سدادات نهاية الفولاذ المقاوم للصدأ. الأداة يخلق وعكس بسرعة حقل مغناطيسي داخل غرفة طحن. كما يتحول المجال المغناطيسي ذهابا وإيابا، والمغناطيس يسحق العينة ضد المقابس وبالتالي تحقيق 'cryogrinding' والسحق من الفشار. تحل طاحونة الفريزر محل الملاط و المهاترات وتسمح بالتجهيـز التسلسلي لعينات متعددة (أو ما يصل إلى 4 عينات أصغر في نفس الوقت) مع قابلية عالية للتكرار وتتجنب التقلبات من المستخدم إلى المستخدم المرتبطة بالطحن اليدوي. بمجرد معالجة العينات، يمكن استخدام مستخلصات الخلايا لمجموعة متنوعة من التطبيقات المتلقية للمعلومات.

<table><tbody><tr><td>50 مل أنابيب البولي كربونات مع أغطية لولبية</td> أنابيب <td>الطرد المركزي</td><td>بيكمان</td><td>357002</td></tr><tr><td>BD Bacto Peptone</td><td>BD Biosiences</td><td>211677</td><td>الخميرة YPD مكون الوسائط</td></tr><tr><td>BD Bacto مستخلص الخميرة</td><td>BD Biosiences</td><td>212750</td><td>الخميرة YPD مكون الوسائط</td></tr><tr><td>بيكمان أفانتي جهاز طرد</td> مركزي <td>بيكمان</td><td>B38624</td><td>جهاز طرد مركزي عالي السرعة</td></tr><tr><td>بيكمان JLA-9.1000</td><td>بيكمان</td><td>366754</td><td>الدوار</td></tr><tr><td>D- (+) - سكر العنب MP اللامائي</td><td>الطب الحيوي</td><td>901521</td><td>الخميرة YPD مكون</td></tr><tr><td>الوسائط Eppendorf A-4-44</td><td>Eppendorf</td><td>22637461</td> دوار <td>دلو متأرجح</td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي مبرد Eppendorf 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>22625101</td><td>جهاز طرد مركزي مبرد</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G5150-1GA</td><td>مستبعد الحجم والتبريد</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>FisherBiotech</td><td>BP310-100</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>HIS6 الجسم المضاد</td><td>Novagen</td><td>70796</td><td>الجسم المضاد ل HIS tag</td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541-1KG</td><td>ملح للحفاظ على القوة الأيونية</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>CALBIOCHEM</td><td>474790</td><td>مثبط البروتيازوم</td></tr><tr><td>كوكتيل مثبط الفوسفاتيز</td><td>ThermoFisher كوكتيل مثبط الفوسفاتيز العلمي</td><td>A32957</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>SIGMA</td><td>P7170-1L</td><td>كوكتيل مثبط البروتياز البقعة</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32963</td><td>كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني</td></tr><tr><td>الدوار JLA 25.500</td><td>بيكمان</td><td>JLA 25.500</td><td>الدوار</td></tr><tr><td>الزدافة الصوديوم</td><td>EM Science</td><td>BX2165-1</td><td>مثبط هيستون ديستيلاز</td></tr><tr><td>فلوريد الصوديوم</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>S6521</td><td>مثبط الفوسفاتيز</td></tr><tr><td>الصوديوم فاناديت</td><td>MP الطب الحيوي</td><td>159664</td><td>مثبط الفوسفاتيز</td></tr><tr><td>الصوديوم بيتا ؛ - جليسيروفوسفات</td><td>ألفا إيسار</td><td>13408-09-8</td><td>مثبط الفوسفاتيز</td></tr><tr><td>Spex Certiprep 6850 مطحنة التجميد</td><td>SPEX عينة الإعدادية</td><td>6850</td><td>مطحنة الفريزر</td></tr><tr><td>TALON Metal Affinity راتنج</td><td>BD Biosiences</td><td>635502</td><td>لسحب البروتينات الموسومة HIS</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>VWR International</td><td>VW1521-07</td><td>المنظفات غير الأيونية</td></tr> <tr><td>بيتا - Mercaptoethanol</td><td>AMRESCO</td><td>M131-250ML</td><td>عامل اختزال</td></tr></tbody></table>

إعداد مقتطفات الخلية من قبل cryogrinding في مطحنة التجميد الآلي

Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

سهولة التلاعب الجيني والحفاظ التطوري القوي للآلات الخلوية eukaryotic في خميرة في مهدها Saccharomyces cerevisiae جعلت من كائن حي النموذج الوراثي البارز. ومع ذلك ، نظرًا لأن عزل البروتين الفعال يعتمد على التعطيل الأمثل للخلايا ، فإن استخدام الخميرة للتحليل الكيميائي الحيوي للبروتينات الخلوية يعوقه جدار الخلية المكلف بهضم الأنزيمية (باستخدام lyticase أو zymolyase) ، ويصعب تعطيله ميكانيكيًا (باستخدام مضرب حبة تقليدي أو مطبعة فرنسية أو طاحونة قهوة) دون التسبب في تسخين العينات ، مما يسبب بدوره تذوّق البروتينات وتدهورها. على الرغم من أن طحن يدوي من خلايا الخميرة تحت النيتروجين السائل (LN2) باستخدام مدافع الهاون و pestle يتجنب ارتفاع درجة حرارة العينات ، فإنه كثيف العمالة ويخضع للتقلب في تحلل الخلايا بين المشغلين. لسنوات عديدة، ونحن قد تم إعداد بنجاح مقتطفات الخميرة عالية الجودة باستخدام cryogrinding الخلايا في مطحنة التجميد الآلي. درجة حرارة -196 درجة مئوية التي تحققت باستخدام LN2 يحمي المواد البيولوجية من التحلل بواسطة البروتيوسات والنيوكلاسيس، مما يسمح باسترجاع البروتينات السليمة والأحماض النووية والجزيئات الأخرى. هنا وصفنا هذه التقنية بالتفصيل لخلايا الخميرة الناشئة التي تنطوي على تجميد أول تعليق الخلايا في عازلة تحلل من خلال إضافة قطرة في LN2 لتوليد قطرات المجمدة من الخلايا المعروفة باسم "الفشار". ثم يتم سحق هذا الفشار تحت LN2 في مطحنة الفريزر لتوليد استخراج "مسحوق" المجمدة التي يتم إذابتها ببطء وتوضيحها عن طريق الطرد المركزي لإزالة الحطام غير قابلة للذوبان. المقتطفات الناتجة جاهزة لتطبيقات المصب، مثل تنقية البروتين أو الحمض النووي، أو التحليلات البروتومية، أو دراسات المناعة المشتركة. هذه التقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع لإعداد استخراج الخلايا من مجموعة متنوعة من الكائنات الحية الدقيقة والأنسجة النباتية والحيوانية والعينات البحرية بما في ذلك الشعاب المرجانية ، فضلا عن عزل الحمض النووي / الجيش الملكي النيبالي من الطب الشرعي والعينات الأحفورية الدائم التجمد.

قارنا طريقتين مختلفتين لتحلل الخلايا الخميرة، وهما طحن حبة الزجاج في 4 °C وطريقة التبريد الآلي في -196 درجة مئوية، لتقييم بروتينات الانتعاش النسبي في مستخلصات الخلايا المعدة مع كلا الطريقتين. لهذه الدراسة، اخترنا لاستخدام سلالة الخميرة الناشئة YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3،-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ubi3-Δub-2 ubi4-Δ2::LEU2 [pUB229] [pUB221])16 تحمل بلازميد نسخة عالية تعبر عن ترادف HIS-MYC الموسومة Ubiquitin (HIS-MYC-Ub) حتى نتم...

نحن وصف طريقة موثوقة لإعداد مستخلصات الخلية كاملة من الخميرة أو الخلايا الأخرى باستخدام مطحنة التجميد المبردة التي تقلل من تدهور وdenaturation البروتينات. مستخلصات الخلايا مناسبة لتنقية مجمعات البروتين الوظيفية، وتحليلات البروتيوم، ودراسات المناعة المشتركة والكشف عن تعديلات البروتين labile.

إعداد مقتطفات الخلية من قبل Cryogrinding في مطحنة التجميد الآلي

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

الخميرة هي كائن حي نموذجي شائع ، ليس فقط للدراسات الجينية ولكن أيضًا للدراسات الكيميائية الحيوية للبروتينات والجزيئات الضامة الأخرى المستخرجة من النوع البري وسلالات الخميرة المتحولة. ومع ذلك ، بسبب جدران الخلايا الصعبة ، فإن التحدي الرئيسي الذي يواجهه الباحثون هو هذا التحلل الفعال لخلايا الخميرة دون الإضرار بالمحتوى الخلوي. عادة ما تكون عزلة الجزيئات الحيوية الحيوية السليمة أمرًا حاسمًا ، وتعتمد على درجة الحرارة.إعداد المستخلصات في درجة حرارة منخفضة يضمن أن البروتياز داخل الخلايا والنيات تبقى غير نشطة، مما يؤدي إلى عزل موثوق بها من البروتين سليمة، والأحماض النووية، والجزيئات الأخرى لتحلل كافية. طرق مختلفة متاحة للحصول على مقتطفات الخميرة من خلال الانزيمية، الكيميائية والفيزيائية. ومع ذلك تحلل الأنزيمية مكلفة بسبب شرط من الانزيمات النقية لهضم جدار الخلية، وبالتالي الحد من استخدام عدد أقل من الخلايا.مزيد من ردود الفعل الأنزيمية يجب أن تكون رصدت عن كثب لمنع أكثر من الهضم وتحلل سابق لأوانه من الخلايا. الأساليب الكيميائية باستخدام عوامل denaturing قوية، على الرغم من فعالية، يؤدي إلى denaturation البروتينات وعلى هذا النحو، ليست مناسبة لعزل مجمعات البروتين أو الإنزيمات الوظيفية. يمكن تنفيذ الطرق الفيزيائية ، مثل التحلل تحت ضغط عال في الصحافة الفرنسية في البرد عند أربعة مئويات ولكن هذا ليس باردًا بما يكفي لمنع تدهور جميع البروتينات المحلية وتآكلها.الأساليب المادية الشعبية الأخرى هي استخدام هاون وحشرات، خلاط، أو طاحونة القهوة لطحن خلايا الخميرة resuspended في عازلة تحلل والمجمدة كما قطرات أو طحن وخليط من الخرز الزجاجي والخميرة في طاحونة سريع خرزة الإعدادية أو تحلل بواسطة sonication. ومع ذلك، طحن يدوي هو العمل المكثف وغلة البروتين الناتجة يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا اعتمادا على التقنيات المستخدمة في حين تحلل عن طريق sonication أو طحن في خلاط، طاحونة القهوة، أو مطحنة الخرز يولد كمية كبيرة من الحرارة، مما يؤدي إلى التآكل البروتين وتدهور. لذلك ، للحصول على تحلل خلايا الخميرة مع البروتينات في حالتها الأصلية مع الحد الأدنى من التآكل والتحلل لتطبيقات مثل تنقية مجمعات البروتين الوظيفية ، والمقايسات الكيميائية الحيوية أو الكشف عن التعديلات العابرة بعد الترجمة ، فمن الضروري استخدام طريقة تحلل قابلة للتطوير بسهولة من شأنها تقليل توليد الحرارة مع السماح للتحلل الفعال بغض النظر عن كمية الخلايا.هنا نصف الطريقة التي تنطوي على استخدام مطحنة التجميد المبرد لتحلل الخلايا في النيتروجين السائل في ناقص 196 درجة مئوية لتوليد مقتطفات الخلايا المجمدة مما يسمح لاستعادة الجزيئات الوظيفية سليمة، مثل البروتينات أو الحمض النووي والحمض النووي، في درجات حرارة منخفضة جدا مما يقلل من التآكل والتدهور. ويمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة للاستخدام مع أي نوع من عينات الخلايا أو الأنسجة من أي نوع، بما في ذلك الطب الشرعي وحتى العينات القديمة التي تم استردادها من المواقع الأثرية أو وجدت مجمدة في الجليد الدائم. تستخدم مطحنة الفريزر غرفة طحن كهرومغناطيسية فائقة التوصيل تتحرك بسرعة شريط معدني صلب ذهابا وإيابا داخل ملف بولي كربونات يحتوي على العينة ليتم سحقها بين المقابس نهاية الفولاذ المقاوم للصدأ.هذا الأسلوب تحلل الخلايا المادية يسمح لتحلل أكثر كفاءة والنتائج reproducibly في استخراج نوعية أفضل. تزرع خلايا الخميرة بتركيز 10 مليون خلية لكل مل. تم وضع هذه الخلايا الخميرة قبل زجاجة الطرد المركزي المبردة ونسج لمدة 10 دقائق في 2، 400 G.مرة كاملة تدور، decant ناكر دون إزعاج الخلايا بيليه.تم إعادة تعليق هذه الكريه في كمية صغيرة من الماء البارد المثلج ، حوالي نصف الحجم الأولي للثقافة لغسل الخلايا. تم نسج الخلايا resuspended مرة أخرى أسفل لمدة 10 دقائق أخرى في 2، 400 G.Once تدور المقبل هو كامل، ونحن، مرة أخرى، decant كل نابيرينت دون إزعاج بيليه. ثم سيتم إعادة تعليق هذه الكريه و 15 مل من الجليد الباردة العازلة التحلل.تأكد من أن بيليه هو resuspended تماما. يجب أن تبقى الخلايا التي تم تعليقها على الجليد في أنبوب ملحوظ مسبقًا حتى تصبح جاهزة للخطوة التالية. ارتدي دائماً معدات الحماية الشخصية عند التعامل مع النيتروجين السائل، مثل نظارات السلامة، وحماية اليدين، ومعاطف المختبر.لتحقيق أقصى قدر من البراعة لدينا، ونحن في كثير من الأحيان ارتداء زوج من القفازات الحرارية البيضاء تقع بين اثنين من أزواج من قفازات نيتريل. تغيير قفازات الخارجي والنيتريل في كثير من الأحيان، لأنها مزق بسهولة بعد التعرض للنيتروجين السائل. في مختبرنا، ننقل اِكاء من النيتروجين السائل إلى حاوية صغيرة من النيتروجين السائل سعة خمسة لترات.ثم يسكب النيتروجين السائل في أنبوب 50 ML الذي تم تبريده مسبقًا على الجليد الجاف. مرة واحدة في أنبوب 50 ML مليء بالنيتروجين السائل، ونحن إضافة استخراج الخميرة ببطء، بطريقة حكيمة قطرة إلى أنبوب في زيادات 1.5 ملليلتر. لتقليل تكوين الكريات الفشار الكبيرة ، يضاف تعليق الخميرة في حركة دائرية.لمزيد من منع تشكيل الكريات الفشار كبيرة، ونحن نستخدم ملقط كبيرة لضمان جميع الكريات بين 0.3 و 0.5 سم في القطر. لأن النيتروجين السائل يتبخر دائما، تأكد من إعادة ملء الأنبوب مع النيتروجين السائل قبل إضافة كل aliquot 1.5 مل من تعليق الخميرة. مرة واحدة وقد بذلت كل من تعليق الخميرة في الفشار تسمح للأنبوب مع الفشار للجلوس دون غطاء لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق للسماح لجميع النيتروجين السائل المتبقية لتتبخر.للتأكد من أن جميع النيتروجين السائل قد تبخرت، أغلق الغطاء تماما تقريبا ويهز بلطف. إذا كان هناك ضوضاء هيسينغ ، فإنه يشير إلى أن النيتروجين السائل لم يتبخر بالكامل بعد. افتح الغطاء لمدة دقيقة أخرى أو نحو ذلك للسماح للنيتروجين السائل المتبقي بالتبخر قبل إغلاق الغطاء بإحكام.قد يسبب السائل المتبقي في الأنبوب انفجارًا إذا تم إغلاق الغطاء قبل الأوان. يمكن تخزين هذا الفشار الخميرة إلى أجل غير مسمى تقريبا في ناقص 80 درجة C.for ما لا يقل عن خمس عينات, ضمان أن لديك 30 إلى 35 لترا من النيتروجين السائل المتاحة. املأ مطحنة التجميد إلى الخط الكامل واغلق الغطاء للسماح لمطحنة الفريزر بالبرد لبضع دقائق.مرة أخرى، تذكر دائما لارتداء معدات الحماية الشخصية عند التعامل مع النيتروجين السائل. يجب أن تكون قوارير طحن البولي، المقابس نهاية الفولاذ المقاوم للصدأ، وشريط المؤثرات مبردة مسبقا مع النيتروجين السائل. الحفاظ على هذه المكونات المغمورة حتى يتوقف النيتروجين السائل محتدما.تذكر أن تبقي جميع عينات الفشار على الجليد الجاف حتى اكتمال عملية الطحن بأكملها. سحب كل النيتروجين السائل من طحن قوارير ونقل الفشار الخاص بك في القارورة. لا تنسى أن تضع شريط المؤثرات المغناطيسية في طحن قارورة كذلك.ختم قارورة طحن عن طريق وضع بعناية المكونات الفولاذ المقاوم للصدأ بالتساوي على نهاية طحن قارورة. نحن الانفجار كل نهاية من قوارير طحن على لوح خبز خشبي مع اهتزاز امتصاص المطاط دعم لضمان أن يتم وضع المقابس نهاية بشكل صحيح ويتم ختم قوارير طحن بإحكام. من المهم تأمين سدادات النهاية لضمان أنها لن تأتي فضفاضة والسماح للعينات لتسرب في مطحنة الفريزر أثناء عملية الطحن.ضع قارورة طحن في غرفة طحن مطحنة الفريزر وقفل في مكانها. أغلق غطاء مطحنة الفريزر وطحن العينة لمدة ثلاث دورات في دقيقتين لكل دورة، بمعدل ساحق قدره 14. بعد دورات طحن كاملة فتح القارورة مع مسحوق خلية المجمدة lysate.لمنع lysate من ذوبان، والعمل بسرعة وبعناية لفك واحدة من المقابس نهاية باستخدام أداة فتح. بمجرد فتح القارورة، قم بإزالة شريط الارتطام ونقل مستخلص المسحوق المجمد بسرعة على طبق وزنها البلاستيكي المبرد مسبقًا. استرداد أكبر قدر من استخراج المجمدة قدر الإمكان عن طريق ضجيجا القارورة على لوح الخبز الخشبي.بمجرد إزالة كل مسحوق من القارورة، بسرعة نقل جميع مستخلصات مسحوق إلى ما قبل المسمى 15 مليون أنبوب الاحتفاظ بها على الجليد الجاف. على الرغم من أنه من الأفضل المضي قدما في ذوبان الذوبان واستخدام مقتطفات على الفور للحد من تدهور البروتين، يمكن تخزين مسحوق المجمدة بين عشية وضحاها في ناقص 80، إذا لزم الأمر. ذوبان خارج مسحوق lysate ببطء في الطين الجليد الذي يتم تداوله باستمرار باستخدام شريط ضجة المغناطيسي في دلو الثلج.لتسهيل حتى ذوبان الجليد، وإزالة الجليد الذي يتطور على السطح الخارجي للأنابيب في كثير من الأحيان، كل خمس دقائق تقريبا أو نحو ذلك. مرة واحدة في استخراج تبدأ في ذوبان في 1X protease المانع كوكتيل و 10 مثبطات البروتين ميكرومولر MG132 لمنع تدهور البروتين. مرة واحدة يتم إذابة العينات تماما، والتي يمكن أن تستغرق أكثر من ساعة، تدور أسفل العينات في 3، 220 G لمدة 20 دقيقة في درجة أربع درجات مئوية.هذا الدوران سوف يزيل معظم حطام الخلية من lysate. عندما تدور كاملة نقل عظمى في زجاجات البولي التي تم تبريدها مسبقا على الجليد والتخلص من بيليه. أجهزة الطرد المركزي الفائقة والعينات في 16، 000 G في درجة أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة لتوضيح استخراج.بعد اكتمال الدوران، يسترجع فقط فائقة واضحة بعناية من منتصف العمود السائل دون إزعاج طبقة غائمة تحتوي على قطعة على رأس أو الحطام بيليه في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي. نقل lysate واضحة في أنبوب 15 مل المبردة الطازجة. يمكن مؤخرا طرد السائل الملبدة بالغيوم المتبقية لمدة خمس دقائق بنفس السرعة للسماح لاسترداد بعض أكثر من lysate الجملة.والمقتطفات جاهزة الآن للاستخدام في التجارب، مثل تنقية مجمعات البروتين والمناعة. قارنا طريقتين مختلفتين من تحلل خلايا الخميرة ، وهما طحن حبة الزجاج في أربع درجات مئوية وطريقة طحن التبريد الآلي في ناقص 196 درجة مئوية لتقييم البروتينات المسترجعة النسبية ومستخلصات الخلايا المعدة بكلتا الطريقتين. من هذه الدراسة اخترنا استخدام سلالة الخميرة في مهدها تحمل بلازميد نسخة عالية التعبير عن ubiquitin مضاف HIS-MYC.حتى نتمكن من تقييم تقارب الانتعاش من البروتينات متعددةubiquitinated الموسومة من مقتطفات بالجملة، بعد تنقية تقارب باستخدام TALON الكوبالت حبات تقارب العلامة HE تليها النشاف الغربية مع جسم مضاد العلامة وحيد النسيلة HIS. البروتينات متعددةubiquitinated التي عادة ما تكون قصيرة جداً عمر بسبب تدهورها السريع من قبل الآلات البروتيما في كل مكان، وبالتالي تقدم طريقة جيدة جداً لمقارنة نوعية مقتطفات الجملة التي أعدتها أساليب مختلفة. كما نرى من قبل النصف الأيمن من بونساو غشاء الملون، استعدنا أعلى غلة البروتين الكلي في مقتطفات بالجملة التي أعدتها بروتوكول مطحنة التجميد كما حكم عليها بونساو أكثر كثافة تلطيخ في جميع أنحاء حارة استخراج الجملة.هذا واضح بشكل خاص في الأجزاء السفلى والعليا من مطحنة التجميد تستخرج الممرات. بالإضافة إلى ذلك، كما هو مبين من قبل النصف الأيمن من العلامة هي بقعة الغربية، لاحظنا انتعاش أفضل من HIS-MYC العلامة في كل مكان البروتين في كل مكان تليها سحب أسفل باستخدام حبات تالون من مقتطفات بالجملة التي أعدتها طحن المبردة. نستنتج أن مطحنة التجميد المبردة متفوقة على الطرق الأخرى لإعداد مستخلصات الخلايا ، خاصة عندما تكون الجزيئات الجزيئات الوظيفية مطلوبة لتطبيق المصب.

preparation-cell-extracts-cryogrinding-an-automated-freezer

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نحن هنا لتوضيح كيفية استخدام الإلكترون cryotomography (ECT) لدراسة التركيب الدقيق للخلايا بكتيرية في القريب الناطقين الدول ، والى "الجزيئات" (~ 4 نانومتر) القرار.

الإلكترون Cryotomography من الخلايا البكتيرية

المصدر: Wiegand, D. J., et al. تعبير البروتين الخالي من الخلايا باستخدام بكتيريا الضمة الطبيعية سريعة النمو. J. Vis. Exp. (2019).يوضح هذا الفيديو تحضير مستخلص خلوي من Vibrio natriegens ، وهي بكتيريا سريعة النمو معروفة بمعدل تخليق البروتين العالي. يتم غسل الحبيبات البكتيرية وتعليقها في عازلة التحلل قبل الصوتنة على الجليد لمنع التدهور الخلوي. يتم طرد المحلل لفصل بقايا الخلايا غير القابلة للذوبان ، ويتم جمع مستخلص الخلية وتجميدها وتخزينها لاستخدامها في المستقبل.

تحضير مستخلص الخلايا الخام من Vibrio natriegens

نحن هنا وصف البروتوكولات لتعطيل خلايا الثدييات من قبل الطحن الحالة الصلبة في درجة حرارة المبردة، إنتاج استخراج الخلايا من مسحوق الخلية الناتجة عن ذلك، وعزل بروتين المجمعات الاهتمام من جانب القبض على تقارب على الخرز ممغطس يقترن الأجسام المضادة ميكرون الحجم.

البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled

تصف هذه المخطوطة وسيلة سهلة الاستخدام ومنخفضة التكلفة كريوفيكساتيون لتصور خلايا تعليق عن طريق انتقال المجهر الإلكتروني.

يغرق التجميد: أداة لدراسات التركيبية وImmunolocalization من خلايا تعليق في نقل المجهر

وترد أداة وأساليب لإعداد مجلدات الحجم نانولتر عينة مجهر إلكتروني. أية خطوات ورقة النشاف مطلوبة، وبالتالي تجنب العواقب الضارة وهذا يمكن أن يكون للبروتينات، إلى حد كبير الحد من فقدان عينة وتمكين تحليل خلية مفردة ليساتي البروتيوميات البصرية.

إعداد عينة المنمنمة مجهر إلكتروني

تم تطوير طريقه السحق المبردة لمعالجه الكفوف murine باستخدام مطحنه النيتروجين السائل التجميد لتحسين الغلة وجوده الحمض الريبي النيبالي أو البروتين المستخرج من الانسجه وتمكين تحليل الملامح الجزيئية المرتبطة التهابات الاستجابات.

بروتوكول تجميد السحق لمعالجه الكفوف الماوس لتقييم المسارات الجزيئية للالتهابات الانسجه في الكولاجين المستحثة نموذج التهاب المفاصل

ويرد هنا بروتوكول لثقافة الخلية علي الاغشيه نيتريد السيليكون ويغرق-تجميد قبل التصوير الشعاعي الاشعه السينية مع السنكروتروني المبردة الاشعه السينية نانوسبر. عندما يتم توفير درجه حرارة الغرفة فقط نانو التحليل ، يمكن ان تكون العينات المجمدة مزيد من التجميد المجفف. هذه هي الخطوات الحاسمة للحصول علي معلومات حول تكوين عنصري داخل الخلايا.

ثقافة الخلية علي اغشيه نيرايد السيليكون والتعويض عن البرد لل Synchrotron الاشعه السينية الفلورية نانو-تحليل

يصف هذا البروتوكول طريقة cryoAPEX ، حيث يمكن ترجمة بروتين غشاء APEX2 الموسوم عن طريق المجهر الإلكتروني المنقول داخل بنية فائقة للخلايا محفوظة على النحو الأمثل.

طريقة CryoAPEX لتحليل المجهر الإلكتروني لتوطين بروتين الغشاء داخل الخلايا المحفوظة فائقة الهيكلية

نحن نقدم تقنية لتحقيق الاستقرار السريع في المجمعات التحويلية (التمثيل الحيوي البروتيني) مع الفورمالديهايد المترابطة في الخميرة الحية وخلايا الثدييات. النهج يتيح تشريح وسيطة عابرة وديناميكية الحمض النووي الريبي: التفاعلات البروتين. يمكن استخدام المجمعات المترابطة في تطبيقات متعددة في المصب مثل طرق التنميط العميق المستندة إلى التسلسل ، والتنظير الدقيق ، وقياس الطيف الكتلي.

تثبيت سريع في Vivo وعزل المجمعات الترجمية من الخلايا Eukaryotic

هنا ، نقدم خط أنابيب لطحن شعاع الأيونات المركز 3D على توجيه إعداد العينات الخلوية للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد. يتم تحديد موقع 3D للبروتينات الموسومة بالفلورسنت ذات الأهمية أولا بواسطة الفحص المجهري الفلوري بالتبريد ، ثم يتم استهدافه للطحن. البروتوكول مناسب للثدييات والخميرة والخلايا البكتيرية.

إعداد العينة بواسطة طحن شعاع الأيونات المركز 3D للتصوير المقطعي عالي الدقة للإلكترون بالتبريد

توفر هذه الطريقة بروتوكولا مرنا يسهل الوصول إليه لإعداد شبكات المجهر الإلكتروني (EM) للتصوير بالتبريد الخلوي في الموقع والمجهر الضوئي والإلكتروني المرتبط (CLEM).

تحضير العينة للتصوير بالتبريد في الموقع لخلايا الثدييات

اكتشف طريقة الطحن البارد لتحضير مستخلصات الخلايا الكاملة من الخميرة مع الحفاظ على سلامة البروتين. تُحسّن هذه التقنية استخلاص الجزيئات الكبيرة الوظيفية للدراسات البروتينية.

إعداد مقتطفات الخلية من قبل Cryogrinding في مطحنة التجميد الآلي

استكشف المزيد من الفيديوهات