عزل أنسجة الجهاز العصبي المركزي والسحايا المرتبطة به لتحليل المصب للخلايا المناعية

يسمح العزل السريع لأنسجة الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك السحايا بإجراء تحليل شامل للنمط الظاهري للخلايا المناعية ووظيفتها وتوطينها في الظروف الاستتبابية والممرضة. تسمح الطريقتان الموضحاتان بالاستخراج السريع لأنسجة الجهاز العصبي المركزي مع السحايا ، وهي مثالية لتحليل المصب باستخدام تقنيات الخلية المفردة والطرق النسيجية. على الرغم من أن النتائج التمثيلية تركز على تحليل الخلايا المناعية ، إلا أنه يمكن استخدام هاتين الطريقتين لتحليل الخلايا المقيمة في الجهاز العصبي المركزي ، بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية والخلايا السمحجية والخلايا البطانية والخلايا اللحمية والخلايا العصبية.

ابدأ بعزل عينات الدماغ والحبل الشوكي من الفئران التي تم قتلها رحيم. بعد إزالة الرأس ، قم بعمل شق خط الوسط في الجلد واقلبه على العينين لتحرير الجمجمة. قطع عظم الأنف لتحرير الفك السفلي من الجمجمة.

ثم قم بإزالة الفك السفلي واللسان والعينين. قطع على طول الجوانب الجانبية للجمجمة لتحرير الأنسجة على طول الصماخ السمعي الخارجي وتقليمها. لجمع عينة الحبل الشوكي ، افصل القفص الصدري عن العمود الفقري عن طريق القطع بالتوازي مع العمود الفقري بمقص حاد.

قم بعمل قطع صغير في المنطقة القطنية السفلية لعزل العمود الفقري ، ثم قم بقص وإزالة أي عضلة متبقية على طول العمود الفقري لكشف الفقرات. عند إجراء إزالة الكلس، افحص العظم يوميا لتحديد ما إذا كانت ناعمة ومرنة. قم بإزالة الأنسجة من محلول EDTA بالملقط ، وضعها على طبق بتري ، واختبر نعومة العظام برفق بإبرة قياس 25.

إذا اخترقت الإبرة العظام بسهولة ، فإن عملية إزالة الكلس تكتمل. لاستخراج غطاء الجمجمة في الدماغ ، قم بعمل شق خط الوسط في الجلد واقلب الجلد على العينين. ضع المقص داخل الثقبة العظيمة وابدأ في قطع الجمجمة بشكل جانبي على طول القشرة باتجاه البصلة الشمية ، مع الحفاظ على الشقوق فوق الصماخ السمعي الخارجي والفك السفلي.

قم بإجراء نفس التخفيضات على الجانب الآخر مع التقاء الجروح عند البصلة الشمية لتحرير غطاء الجمجمة من الدماغ. باستخدام الملقط ، قشر غطاء الجمجمة وضعه في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من وسط RPMI البارد المكمل ب 25 ملليمولر HEPES. ضع ملقطا منحنيا أسفل قاعدة الدماغ وارفعها لتحرير الدماغ من غطاء الجمجمة.

استخرج العمود الفقري وأنسجة الحبل الشوكي عن طريق القطع بالتوازي مع العمود الفقري لفصل القفص الصدري عن العمود الفقري. ثم قم بعمل قطع صغير في منطقة أسفل الظهر لعزل عمود الفقرات. تقليم وإزالة أي عضلة متبقية على طول العمود الفقري لكشف الفقرات.

بعد ذلك ، ضع المقص الجراحي الدقيق للغاية داخل العمود الفقري واقطع على طول الحافة الجانبية للعمود. قطع الحافة الجانبية المقابلة تماما لتقسيم العمود الفقري إلى جزء أمامي وخلفي. استخدم الملقط لتقشير الحبل الشوكي ببطء وحذر من العمود الفقري ووضعه في أنبوب مخروطي الشكل سعة 15 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من RPMI البارد مع 25 ملليمولر HEPES.

ثم انقل الأجزاء الأمامية والخلفية من العمود الفقري إلى أنبوب آخر. لإزالة السحايا من غطاء الجمجمة ، أخرج غطاء الجمجمة من وسائط RPMI واستخدم ملقطا حادا للتسجيل حول الحافة الخارجية. قشر السحايا بعيدا عن حافة غطاء الجمجمة ، وكشط لإزالة السحايا الجافية والعنكبوتية ووضع السحايا على طبق بتري.

لإزالة السحايا من العمود الفقري ، أخرج العمود من الوسائط وقم بتسجيل حواف العمود الفقري باستخدام ملقط حاد لتحرير السحايا. استخدم ملقطا منحنيا لتقشير السحايا من حافة الفقرات ووضع السحايا على طبق بتري. ضع مصفاة شبكية من النايلون في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

لإنشاء معلق خلوي ، انقل السحايا إلى مصفاة وأضف ثلاثة ملليلتر من RPM المكملة ب HEPES ، ثم استخدم مكبسا من حقنة سعة خمسة ملليلتر لطحن الأنسجة والوسائط من خلال المصفاة. صب أنسجة الدماغ أو الحبل الشوكي مع الوسائط في طبق بتري 100 ملم واستخدم الملقط لنقل الأنسجة إلى الأسفل. افرم أنسجة المخ بشفرة حلاقة معقمة واجمع الأنسجة في الجزء السفلي من اللوحة.

أضف ثلاثة ملليلتر من RPMI مكملا بنسبة 10٪ FCS إلى طبق بتري ، ثم استخدم ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر لإعادة تعليق الأنسجة في الوسائط ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. أضف الكولاجيناز من النوع 1 و DNase 1 إلى الأنسجة واحتضان الأنابيب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. اقلب الأنابيب كل 15 دقيقة لخلط الأنسجة جيدا مع الإنزيمات.

بعد الحضانة ، أضف EDTA إلى كل أنبوب للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.01 مولار واحتضان الأنابيب لمدة خمس دقائق إضافية لتعطيل الكولاجيناز. أضف تسعة ملليلتر من RPMI مكملا بنسبة 10٪ FCS إلى كل أنبوب ، ثم قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 450 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. استخدم ماصة باستور مع فراغ لشفط المادة الطافية ، مع الحرص على عدم لمس حبيبات الخلية.

أضف ثلاثة ملليلتر من محلول تدرج الكثافة متساوي التوتر بنسبة 100٪ إلى حبيبات الخلية ، ثم أضف وسائط RPMI 10٪ FCS إضافية لرفع الحجم النهائي إلى 10 ملليلتر وإعادة تعليق حبيبات الخلية. اقلب الأنبوب واخلطه جيدا ، ثم أدخل ماصة مصلية مع مليلتر واحد من محلول تدرج كثافة متساوي التوتر 70٪ في قاع الأنبوب. ضع الأساس ببطء للحل ، مع الحرص على عدم صنع الفقاعات.

قم بإزالة الماصة المصلية من الأنبوب، مع التأكد من عدم إزعاج التدرج. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 800 جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، ثم استنشق المادة الطافية ، بما في ذلك طبقة حطام المايلين ، حتى يبقى ملليلترات إلى ثلاثة ملليلترات في الأنبوب. استخدم ماصة سعة مليلتر واحد لحصاد طبقة الخلية بين تدرج الكثافة 30٪ و 70٪ ونقلها إلى أنبوب جديد سعة 15 ملليلترا.

أضف وسائط RPMI 10٪ FCS لرفع الحجم النهائي إلى 15 مليلترا ، ثم قم بالطرد المركزي للخلايا عند 450 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تم استخدام هذا البروتوكول لتقييم الخلايا البائية والتائية في السحايا والدماغ والحبل الشوكي أثناء التصلب المتعدد التدريجي. تم إجراء البوابات لتمييز الخلايا المناعية عالية المشتقة من المحيط CD45 من الخلايا الدبقية الصغيرة المنخفضة CD45 والخلايا العصبية السلبية CD45 والخلايا النجمية والخلايا الدبقية قليلة التغصن.

كان هناك عدد قليل من الخلايا العالية CD45 في الحبل الشوكي وأنسجة المخ للفئران المعالجة بالوهم. تم استخدام نفس قطع البوابة للتعبير العالي CD45 في السحايا لتحديد خلايا المناعة العالية CD45 واستبعاد الخلايا غير المناعية. في جميع أنسجة الجهاز العصبي المركزي TMEV-IDD ، لوحظت زيادة النسب المئوية للخلايا المناعية العالية CD45 مقارنة بالفئران المعالجة الوهمية.

أثناء TMEV-IDD المزمن ، كانت النسبة المئوية للخلايا البائية بين خلايا المناعة العالية CD45 في الدماغ والحبل الشوكي أعلى مقارنة بحيز السحايا. تم تصوير الأدمغة والحبال الشوكية منزوعة الكلسات لتحديد توطين الخلايا البائية والتائية داخل حجرة الجهاز العصبي المركزي. أدى الاستخراج التقليدي للدماغ من غطاء الجمجمة إلى طبقة بيا سليمة ، ولكن تم استبعاد طبقات السحايا المتبقية.

في كل من الأدمغة والحبال الشوكية ، كانت جميع طبقات السحايا سليمة. تم توطين الخلايا البائية المتحولة من النمط المتساوي والخلايا التائية بتعبير IgG و CD3 ، على التوالي. كشف التزامن بين IgG مع ER-TR7 أن الخلايا البائية كانت موجودة في حمة الجهاز العصبي المركزي والسحايا ، بينما احتوت المجاميع الخلوية داخل السحايا الإيجابية ER-TR7 على العديد من الخلايا البائية الإيجابية IgG والخلايا التائية الإيجابية CD3.

تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في هذه البروتوكولات في الاستخراج الدقيق لأنسجة الجهاز العصبي المركزي ، وهو أمر ضروري لتحسين نقاء معلقات الخلية المفردة والحصول على أنسجة نسيجية ذات مورفولوجيا عالية الجودة. تسمح التقنيات الموصوفة بإجراء تحليل شامل للخلايا التي تشغل حجرة الجهاز العصبي المركزي ، وهي مثالية لفحص النمط الظاهري للخلية ووظيفتها وتوطينها تحت التوازن وأثناء التسبب في المرض.