التمايز العصبي من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في المختبر

التمايز العصبي من فحوصات الفئران نموذجا ممتازا لتوضيح الآليات الرئيسية التي ينطوي عليها تكوين الخلايا العصبية. نعرض طريقة محسنة لتكوين الخلايا العصبية الجنينية باستخدام استراتيجية فحص تورو للشركة. تتميز هذه التقنية بمزايا الكفاءة العالية والتكلفة المنخفضة والتشغيل السهل ، وهي مناسبة للتعميم بين المختبرات.

إنها أداة قوية لأبحاث علم الأعصاب. لإجراء التمايز باستخدام البروتوكول الأول ، قم بزرع 20،000 من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر في ملليلترين من وسط التمايز القاعدي في كل بئر من صفيحة ستة آبار مغلفة بالجيلاتين بنسبة 0.1٪. بعد ربط الخلية ، اغسل الخلايا بملليلترين من PBS وأضف ملليلترين من وسط التمايز القاعدي لكل بئر ، ثم أعد الخلايا إلى الحاضنة.

اسمح للخلايا بالتمايز لمدة ثمانية أيام ، واستبدال الوسط كل يومين. لتنفيذ البروتوكول الثاني ، أضف 1.5 مليون خلية جذعية جنينية للفأر إلى طبق بكتيري غير لاصق في 10 مل من وسط التمايز القاعدي واحتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح بتكوين الجسم الجنيني. بعد يومين ، انقل تجمعات الخلية إلى أنابيب طرد مركزي سعة 15 مليلتر واتركها تستقر عن طريق الجاذبية.

قم بإزالة المادة الطافية وأضف 10 مل من وسط التمايز القاعدي الطازج لإعادة تعليق الأجسام الجنينية. ثم أعد زرعها في طبق جديد غير لاصق واحتضانها لمدة يومين آخرين. اجمع وبذر حوالي 50 جسما جنينيا في ملليلترين من وسط التمايز القاعدي لكل بئر على صفيحة ستة آبار مطلية بالجيلاتين.

لتحريض حمض الريتينويك ، أضف ميكرولترين من مخزون RA في كل بئر إلى التركيز النهائي لميكرومولار واحد. أعد اللوحة إلى الحاضنة وقم بتمييز الخلايا لمدة أربعة أيام أخرى. لإجراء التمايز باستخدام البروتوكول الثالث ، كرر البروتوكول الثاني ولكن اسمح بيومين فقط لتكوين الجسم الجنيني وستة أيام لتحريض التهاب المفاصل الروماتوي.

يجب إجراء مراقبة الجودة لتكوين الأجسام الجنينية باستخدام الفحص المجهري. فقط أولئك الذين لديهم نوى ساطعة يمكنهم التمايز بنجاح في العملية اللاحقة. بالنسبة للبروتوكول الرابع ، قم بزرع 20،000 خلية جذعية جنينية للفأر لكل بئر في الصفائح المطلية بالجيلاتين واتبع البروتوكول الأول.

بعد السماح للخلايا بالتمايز لمدة أربعة أيام ، أضف ميكرولترين من كل مخزون RA العابر في كل بئر واحتضان اللوحة لمدة أربعة أيام أخرى. لتنفيذ البروتوكول الخامس ، كرر البروتوكول الرابع ولكن ابدأ تحريض RA بعد يومين فقط من التمايز. بالنسبة للبروتوكول السادس ، قم بزرع 1.5 مليون خلية جذعية في طبق بكتيري غير لاصق في 10 ملليلتر من N2B27 متوسط اثنين واحتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح بتكوين الجسم الجنيني.

بعد يومين ، اجمع مجاميع الخلايا كما هو موضح سابقا وأعد تعليق الأجسام الجنينية ب 10 مل من N2B27 الطازج متوسط اثنين. أعد زرعها في طبق بكتيري جديد غير لاصق واسمح بالتمايز لمدة يومين آخرين. في اليوم الرابع ، اجمع وبذر حوالي 50 جسما جنينيا في كل بئر على ستة ألواح بئر مطلية بالجيلاتين مع ملليلترين من N2B27 متوسط اثنين.

أضف ميكرولترين من كل مخزون RA المتحولة إلى كل بئر وقم بتحفيز التمايز لمدة أربعة أيام أخرى. لتنفيذ البروتوكول السابع ، قم بزرع حوالي 20،000 خلية في ملليلترين من وسط التمايز القاعدي لكل بئر على الألواح المطلية بالجيلاتين. بعد ربط الخلية وغسلتين باستخدام PBS ، أضف ملليلترين من N2B7 متوسط اثنين إلى كل بئر واسمح للخلايا بالتمايز لمدة ثمانية أيام عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد إجراء تمايز المرحلة الأولى باستخدام البروتوكول الثالث ، قم بزرع حوالي 500،000 مشتقات الخلايا الجذعية الجنينية للفأر في ملليلترين من وسط التمايز القاعدي لكل بئر على الألواح المطلية بالجيلاتين بنسبة 0.1٪. قسم المشتقات بشكل عشوائي إلى ثلاث مجموعات من أجل اختبار بروتوكولات التمايز ثلاثية الأطوار. احتضن اللوحة لمدة ست ساعات ، ثم اغسل الخلايا مرتين بمليلترين من PBS وأضف ملليلترين من وسط التمايز القاعدي N2B27 متوسط واحد أو N2B27 متوسط اثنين لكل بئر ، اعتمادا على البروتوكول.

ضع الشفرات في الحاضنة واسمح للخلايا بالتمايز لمدة 10 أيام أخرى ، مع تغيير الوسط المقابل كل يومين. تم اختبار سبعة بروتوكولات لتحديد البروتوكول الأمثل لتمايز الخلايا الجذعية الجنينية للفأر في الخلايا السليفة العامة أو الشخصيات غير القابلة للعب. تم اختبار البروتوكولات على كل من أقفال A2lox و 129 خلية وتمت مراقبة حالة التمايز لكل مجموعة باستخدام مجهر ضوئي.

أظهرت معظم مشتقات A2lox و 129 أشكالا مكدسة جيدا وشبيهة بالعصبيات بموجب البروتوكول الثالث الذي يشير إلى تكوين الشخصيات غير القابلة للعب. ومع ذلك ، ظهرت الخلايا المتمايزة باستخدام البروتوكول الثاني موت الخلايا المبرمج والتي قد تكون بسبب نقص العناصر الغذائية داخل الأجسام الجنينية. لمزيد من التأكيد على تكوين الشخصيات غير القابلة للعب ، تم الكشف عن الخلايا الإيجابية للعش باستخدام مقايسة التألق المناعي.

نتج عن البروتوكول الثالث أعلى نسبة من الخلايا الإيجابية للنستين تصل إلى 78 و 69٪ في A2lox و 129 مشتقا على التوالي. تم اختبار ثلاثة بروتوكولات لتمايز الشخصيات غير القابلة للعب إلى خلايا عصبية. تقرر أن البروتوكول الثالث يحفز التمايز بشكل أكثر فعالية.

معظم مشتقات A2lox و 129 في المرحلة الثانية من البروتوكول الثالث لها هياكل طويلة تشبه الخلايا العصبية مع عصبات واضحة وامتدادات جسم الخلية. أكدت فحوصات التألق المناعي أيضا توليد الخلايا العصبية بنسبة بيتا توبولين ثلاث خلايا موجبة تصل إلى 68 و 59٪ في A2lox و 129 مشتقا على التوالي باستخدام البروتوكول الثالث. عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم التأكد من أن فحوصات الماوس صحية وغير متمايزة قبل التمايز.

بالإضافة إلى ذلك ، يجب إجراء رقابة صارمة على الجودة بعد التكوين في الأجسام المجوبة وقبل المرحلة الثانية من التمايز. توفر هذه التقنية نموذجا قياسيا للباحثين في علم الأعصاب وعلم الأحياء التنموي ومن المتوقع أن تكون أداة قوية لتوضيح الآليات الرئيسية التي ينطوي عليها تكوين الخلايا العصبية.