تقييم الأكسدة الخلوية باستخدام مقصورة فرعية خاصة ببروتين الفلورسنت الأخضر الحساس للأكسدة الحمراء
يونيو 18, 2020
يصف هذا البروتوكول تقييم حالة الأكسدة الخاصة بالحجرة الفرعية داخل الخلية. يسمح مسبار الفلورسنت الحساس لل الأكسدة بالتحليل التناسبي المريح في الخلايا السليمة.
المقيّمون البروتوكول الحاليون في النسيج، تتغير حالة الأكسدة الحمراء بطريقة خاصة بالحجرة داخل الخلايا. بروتوكول لدينا تمكن من فهم أفضل ورصد جميع الآليات الفسيولوجية أو الفيزيولوجية من الإجهاد التأ المؤسد. تسمح هذه التقنية بالتدميم الكمي غير التخريبي لنسبة كبريتيد العين المبلط في الخلايا السليمة باستخدام مخرج قياسي نسبة لموازنة الاختلافات بين مستويات التعبير إشارة، تبييض الصور، والكشف عن الحساسيات.
يمكن تطبيق هذا البروتوكول على الكائنات الحية المختلفة، بما في ذلك البكتيريا في النباتات. في اليوم الأول من التجربة علاج الخلايا من خط خلية سرطان الثدي التقاء لمدة دقيقتين، مع ملليلتر من 0.2، 5٪ رحلات في EDTA. عندما تبدأ الخلايا لفصل القبض على رد الفعل مع ستة ملليلتر من كامل المتوسطة والرواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
إعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من الطازجة, متوسطة كاملة, عد الخلايا وتمييع لهم إلى 1.5 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من المتوسط الكامل. ثم البذور 1.5 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من الخلايا في بئر في لوحة 6 جيدا، واحتضان الخلايا في الحاضنة ثقافة الخلية بين عشية وضحاها. أو لا تضيف أي الصف الفيروسية GFP نقل.
في صباح اليوم التالي، إضافة 12.5، 25، و 50 ميكرولتر من واحد إلى 100 المخفف ست مرات 10 إلى تشكيل وحدات البلاك 10 لكل ملليلتر من إضافة أي فيروس تآكل حل GFP، في المتوسطة كاملة. إضافة إلى أن الآبار المناسبة أو 6 آبار لوحة لtransduce الخلايا مع 50 و 100 و 200 تعدد العدوى، على التوالي. عندما تم نقل كل من الآبار عينة مع الفيروس، والعودة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 16 إلى 24 ساعة.
في اليوم التالي، تصور الخلايا عن طريق المجهر الفلوريستين واستبدال نابيرنت مع المتوسطة، دون فيروس للسماح للخلايا لاسترداد لمدة 24 ساعة إضافية. لتحديد الكفاءة المثلى في عملية النقل، قم بتقييم كثافة الفلورس ومورفولوجيا الخلايا بواسطة عملية استئصال الخلايا المتدفقة. تأكد من إجراء جميع الإجراءات التي يمكن أن تسبب العدوى من الهباء الجوي أو البقع داخل مستوى السلامة البيولوجية اثنين من مجلس الوزراء السلامة البيولوجية المعتمدة.
لتقييم حالة الأكسدة الحمراء للخلايا ، في صباح اليوم التالي ، احتضان الخلايا والآبار المناسبة من لوحة 6 بئر مع 10 بيروكسيد الهيدروجين ميكرومولار لمدة ساعة واحدة ، قبل فصل الخلايا مع 750 ميكرولترات من 0.2 ٪ التنقيط في EDTA في البئر ، كما ثبت. وقف التفاعل مع مليلترين من المتوسط الكامل في البئر وسحب supernatants لكل حالة في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر الفردية. رواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي وغسل الكريات في 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني في البئر عن طريق الطرد المركزي مرتين.
بعد الغسيل الثاني، قم بتصفية تعليق الخلايا من خلال 40 مترًا صغيرًا في أنابيب متوافقة مع قياس الخلايا على الجليد، محمية من الضوء. في برنامج مقياس التدفق، قم بتشغيل التعدد الصفري لعينة التحكم في العدوى. ثم تحليل بيروكسيد الهيدروجين والخلايا غير المعالجة.
وسيتيح حساب متوسط نسبة كثافة الفلورسنت بين الأشكال المؤكدة مقابل الأشكال المخفضة للصف من أجل الانبعاثات الإجمالية، باستخدام الصيغة كما هو مبين. وهنا تظهر استراتيجية الغات لاختيار عدد كبير من الخلايا عن طريق تدفق cytometry. ويمكن أيضا أن تستخدم تدفق cytometry لتحديد منحنى استجابة الجرعة لتحليل GFP الصف والتعدد الأكثر كفاءة من مدخلات العدوى.
وفقا لتعدد العدوى، منحنى استجابة الجرعة في هذا التحليل التمثيلي، و 200 تعدد العدوى أعطى أعلى تعبير GFP الطريق، ولكن تم تنفيذ مورفولوجيا الخلية مما يوحي السمية الخلوية. ولذلك، تم تحديد كفاءة النقل الأمثل لتكون تعدد العدوى من 100. في هذا التحليل حالة الأكسدة، وأكسدة وانخفاض الصف GFP يعني تم الحصول على كثافة الفلوريسنس من تحليل تدفق قياس خلايا للمركبة وأربعة 10 ميكرومولار إيجابية التحكم في علاجات بيروكسيد الهيدروجين.
تمثل الرسوم البيانية المتراكبة التحولات في رقم الخلية في 10 ميكرومولار بيروكسيد الهيدروجين والمجموعات المعالجة مركبة أو انخفاض وأكسدة تآكل GFP. وحساب النسبة بين الصف المؤسد والمخفض GFP لهذا التحليل كشف أن 10 ميكرومولار بيروكسيد الهيدروجين تسبب في زيادة ثلاثة أضعاف في أكسدة الصف GFP مقارنة مع معالجة السيارة. وجود أرقام الخلايا دقيقة مهم لحسابات التصوير بالرنين المغناطيسي وإعادة إنتاج.
من أجل الحصول على نتائج قابلة للاستنساخ ، يجب على الباحثين خلط الحلول المضادة للفيروسات بشكل شامل للحصول على تعليق متجانس. يسمح هذا البروتوكول للباحثين بدراسة التغيرات السريعة في الأكسدة الحمراء كجزء لا يتجزأ من النطاق الواسع للعمليات الخلوية العادية وتطور المرض في الوقت الحقيقي.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول طريقة لتقييم حالة الأكسدة والاختزال الخاصة بالمحاور دون الخلوية داخل الخلايا باستخدام مسبار فلورسنت حساس للأكسدة والاختزال. تسمح هذه التقنية بقياس كمي غير تدخلي لحالة الأكسدة والاختزال في الخلايا السليمة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- بيولوجيا الأكسدة والاختزال
- الإجهاد التأكسدي
الخلفية
- فهم حالات الأكسدة والاختزال ضروري لدراسة الإجهاد التأكسدي.
- توفر المسابير الحساسة للأكسدة والاختزال رؤى حول الآليات الخلوية.
- يمكن أن تشير التغيرات في حالة الأكسدة والاختزال إلى حالات فسيولوجية أو مرضية.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة على كائنات حية مختلفة.
هدف الدراسة
- لتمكين مراقبة الإجهاد التأكسدي في الخلايا.
- لتوفير طريقة غير تدخلية لقياس حالات الأكسدة والاختزال.
- لتعزيز فهم الاستجابات الخلوية للظروف المؤكسدة.
الطرق المستخدمة
- استخدام مسبار فلورسنت حساس للأكسدة والاختزال.
- تحليل نسبي لموازنة اختلافات الإشارة.
- تطبيق البروتوكول على أنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا السرطانية.
- معالجة الخلايا والطرد المركزي لتحضير العينة.
النتائج الرئيسية
- قياس ناجح لحالات الأكسدة والاختزال في الخلايا السليمة.
- تبيين قابلية التطبيق عبر أنواع مختلفة من الخلايا.
- توفير رؤى حول الآليات الفسيولوجية للإجهاد التأكسدي.
- تمكين مراقبة تغيرات الأكسدة والاختزال في الوقت الفعلي.
الاستنتاجات
- هذا البروتوكول فعال لتقييم حالة الأكسدة والاختزال في الخلايا.
- يوفر أداة قيّمة لدراسة آليات الإجهاد التأكسدي.
- يمكن تكييف الطريقة لمختلف التطبيقات البحثية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Assessing subcellular redox dynamics enables mechanistic de-risking in target validation by linking oxidative stress pathways to disease phenotypes. This method supports predictive confidence in preclinical models through quantitative, ratiometric readouts of cellular oxidation states. It provides translational continuity from discovery to lead identification by monitoring redox changes in living systems without disrupting cellular physiology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying redox shifts in response to oxidative stressors like H2O2.
- Operational Value: Enables functional target validation via subcellular compartment-specific resolution of roGFP signal.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by establishing dose-response relationships between oxidant exposure and GFP oxidation ratios.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening by establishing baseline redox states in MDA-MB-231 cells.
- Operational Value: Delivers assay standardization through ratiometric measurement that corrects for expression variability and photobleaching.
- Scalability: Supports platform reuse across cell types and organisms as demonstrated in breast cancer and bacterial models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Biomarker Alignment: Connects redox measurements to disease-relevant systems using triple-negative breast cancer as a pathophysiological model.
- Preclinical Continuity: Enables risk-adjusted advancement decisions by monitoring real-time redox changes during disease progression.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking by linking oxidative stress mechanisms to functional cellular outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work by providing redox status as a quantifiable biomarker.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring oxidation/reduction ratios in live cells.
- Screening: Ensures assay readiness and reproducibility through flow cytometry-compatible sample preparation and gating strategies.
- Analytics: Delivers quantitative readouts via mean fluorescent intensity ratios of oxidized versus reduced roGFP forms.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling real-time monitoring of redox changes in disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for oxidative stress assessment across multiple projects and cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in oxidative stress mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of redox measurements across experimental conditions.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early pathway de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative redox response thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, flow cytometry, and adenoviral transduction techniques.
- Needs instrumentation for dual-excitation fluorescence detection (405 nm and 488 nm) and emission at 525 nm.
- Demands cross-team standardization of transduction protocols, H2O2 treatment timing, and ratio calculation methods.
- Involves adaptation considerations for different subcellular targeting of roGFP constructs beyond cytosolic expression.
- Includes practical limitations such as cytotoxicity at high multiplicity of infection, requiring optimization for each cell type.
