متوازي عالية الإنتاجية واحد جزيء واحد اختبار حركي لشق الحمض النووي الموقع محددة

يمكن تطبيق هذا البروتوكول على أي عملية تؤدي إلى فواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل ، وتسفر عن بيانات كمية مفصلة عن الحركية. على الرغم من أن هذه الطريقة لديها قرار جزيء واحد، فإنه يقيس ما يصل إلى 1000 DNAs في تجربة واحدة، وبالتالي توفير إحصاءات جيدة. والتطبيق الأساسي لهذه الطريقة هو دراسة الآليات التي تنطوي عليها عملية ربط الحمض النووي وتعديله.

على سبيل المثال، نحن مهتمون بدراسة البحث عن هدف الحمض النووي، وهو أمر ذو صلة بجميع بروتينات الحمض النووي الملزمة. عند محاولة هذه التقنية للمرة الأولى، تذكر أن الحبال جزيء واحد حساسة، وشكل مرة واحدة، يجب التعامل معها بعناية. نسبة مناسبة من الأسطح الوظيفية أمر ضروري.

هناك بعض الحيل لجعل تدفق ذلك. بالإضافة إلى تبديل أنابيب العينات أثناء جمع البيانات، يمكن أن يساعد العرض التوضيحي المرئي شخصًا جديدًا في هذا الإجراء. لغسل زلات الغطاء، ووضعها في تلطيخ الجرار و sonicate لهم مع الإيثانول لمدة 30 دقيقة.

شطف بدقة لهم مع المياه المقطّعة والمقطّعة، ثم تزج بها في هيدروكسيد البوتاسيوم الولي واحد و sonicate لهم لمدة 30 دقيقة أخرى. كرر تسلسل الغسيل، مع التأكد من شطف الغطاء بالماء بعد كل غسل. تخزين زلات الغطاء النظيف في الجرار تلطيخ بالماء.

استخدام شفرة نظيفة لقطع ثمانية سنتيمتر طويلة تحميل والخروج أنابيب، وإدراجها في ثقوب في شريحة زجاجية نظيفة. الايبوكسي الأنابيب والسماح للعلاج لمدة خمس دقائق لتأمينه. تطبيق الشريط من جانبين قبل قص مع نمط القناة إلى الشرائح الزجاجية، وسلس بها مع ملقط من البلاستيك لتحقيق ختم جيد.

قشر التراجع عن الشريط، وتطبيق زلة غطاء نظيفة، وتنعيم بها مع ملقط. ثم، الايبوكسي حافة زلة الغطاء لختم الخلية تدفق والسماح لها علاج. إعداد الحمض النووي المسمى للربط عن طريق إجراء PCR وفقا لاتجاهات المخطوطات.

ثم تنقية المنتج PCR مع مجموعة تنظيف PCR. إعداد 10 ملليلتر من العازلة A، و degas في desiccator فراغ لمدة ساعة واحدة على الأقل. لوظيفية الخلية تدفق، حقن 25 ميكرولتردات من شظايا المضادة للحفر و fab في برنامج تلفزيوني، في قناة التدفق، وذلك باستخدام تلميح هلام تحميل لتناسب أنابيب PE60.

احتضان خلية تدفق في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، سحب 0.5 ملليلتر من العازلة A من خلال قناة مع حقنة، مع الحرص على عدم إدخال الهواء في القناة. ثم، جبل الخلية تدفق على مجهر مقلوب.

عقف أنبوب منفذ إلى مضخة حقنة، ووضع أنبوب مدخل في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير يحتوي على العازلة A.يدويا سحب ما لا يقل عن 0.5 ملليلتر من المخزن المؤقت أ لطرد النظام ورئيس المضخة. ثم اسمحوا مضخة تشغيل في 10 ميكروليتر في الدقيقة الواحدة لمدة خمس دقائق على الأقل لتكدير النظام. دوامة زجاجة الأسهم من الخرز، والماصات 1.6 ميكرولترات من الخرز في 50 ميكرولترات من العازلة A، ثم دوامة لهم مرة أخرى.

ضع الخرز على فاصل مغناطيسي وماصة خارج المخزن المؤقت. إعادة تعليق لهم في 50 ميكروليتر من العازلة A ودوامة لهم. بعد الغسيل الأخير، إعادة تعليق الخرز في 100 ميكرولترات من العازلة A لتركيز النهائي من 160 ميكروغرام لكل ملليلتر.

إعداد 480 ميكرولترات من 0.5 picomolar المسمى الركيزة الحمض النووي في العازلة A، والماصات 20 ميكرولترات من تعليق حبة في الحمض النووي المخفف. ضع الخليط على دوار لمدة ثلاث دقائق. بعد الدقائق الثلاث، قم بتحميل العينة على الفور في القناة بمعدل تدفق 10 ميكرولترات في الدقيقة لمدة 15 دقيقة، أو حتى يتم ملاحظة ربط الخرز الكافي.

غسل قناة جميع الخرز الحرة عن طريق تحويل أنبوب مدخل إلى أنبوب جديد من العازلة A، وتدفقها في 50 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة لمدة 10 دقيقة على الأقل أو حتى يتم ملاحظة أي حبات فضفاضة. ومن المفيد استخدام صمام مضمن لقطع التدفق وتبديل الأنابيب. التبديل أنابيب في حركة واحدة على نحو سلس وتأكد مستويات السائل في أنابيب عينة جديدة والقديمة المباراة لتجنب تدفق الظهر.

قبل جمع البيانات، وإعداد التركيز الصحيح من انزيم الانقسام DNA، وإدراج أنبوب مدخل في العينة. خفض المغناطيس على الخلية تدفق. تعيين مضخة لحقن 80 ميكرولترات من العينة في 150 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة والبدء في جمع البيانات.

دقيقة واحدة في جمع البيانات، وتفعيل المضخة. يظهر هنا هو صورة تمثيلية من حبات المربوطة قبل وبعد رد الفعل. تم إجراء تحليل البيانات لتحديد عدد الخرز المتبقية المربوطة في جميع أنحاء تفاعل الانقسام.

وقد استخدمت هذه التقنية لقياس الموقع محددة معدلات الانقسام الحمض النووي من Nde1 لتركيزات البروتين تتراوح بين 0.25 إلى أربع وحدات لكل ملليلتر، وتركيزين مختلفين من المغنيسيوم. تم تكرار كل حالة مرتين على الأقل ، مع عدد قليل من الحمض النووي المربوطة 100 إلى 1000 لكل تجربة. في تركيزات البروتين منخفضة بما فيه الكفاية، ومعدل يتناسب مع البروتين ومستقلة عن المغنيسيوم.

بالنسبة لتركيزات البروتين العالية ، يعتمد المعدل على المغنيسيوم ، ولكن مستقل عن تركيز البروتين. عند محاولة هذا البروتوكول، ضع في اعتبارك أن فقاعات الهواء في قناة الأنابيب والتدفق يمكن أن تعمل على التجربة. تأكد من عدم السماح لأي هواء في الخطوط أثناء تبديل الأنابيب ، و degas جميع المخازن المؤقتة قبل استخدام.

طريقة الربط يسمح للمرء لاستكشاف تأثير التوتر في الحمض النووي على رد الفعل. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق تغيير قوة المغناطيس أو تطبيق تدفق أثناء جمع البيانات.