Loop-بوساطة التضخيم متساوي الحرارة لفحص السالمونيلا في الغذاء الحيواني وتأكيد السالمونيلا من عزلة الثقافة
مايو 20, 2020
التضخيم الحراري الأيزوحرارية (LAMP) بوساطة حلقة هو اختبار تضخيم حمض النوى الحرارية (iNAAT) الذي اجتذب اهتمامًا واسعًا في مجال الكشف عن مسببات الأمراض. هنا، نقدم بروتوكول مصباح السالمونيلا متعدد المختبرات كوسيلة سريعة وموثوقة وقوية لفحص السالمونيلا في الغذاء الحيواني وتأكيد السالمونيلا المفترضة من عزلة الثقافة.
تم دمج طريقة السالمونيلا LAMP هذه في الدليل التحليلي البكتريولوجي الصادر عن إدارة الغذاء والدواء الأمريكية ، كطريقة فحص في الأغذية الحيوانية وطريقة تأكيد لأي عزلات سالمونيلا مفترضة. الطريقة سريعة وموثوقة وقوية. بالمقارنة مع تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تشمل مزاياها الرئيسية الاختبار السريع ، والأجهزة البسيطة ، والمعدل السلبي الخاطئ المنخفض ، وسير العمل المرن.
يلعب الفحص السريع لمسببات الأمراض مثل السالمونيلا دورا مهما في الكشف السريع عن منتج يحتمل أن يكون ملوثا ويمكن أن يمنع الأمراض أو تفشي المرض في البشر. ابدأ بإعداد قوالب الحمض النووي لمقايسة LAMP هناك نوعان من العينات المستخدمة لصنع قوالب الحمض النووي.
لتحضير قوالب من عينات الأغذية الحيوانية ، قم بوزن 25 جراما من عينة الطعام في كيس مرشح معقم. أضف 225 مل من ماء الببتون المعقم إلى الكيس واحتضنه عند 35 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة ، انقل ملليلتر واحد من الجانب المصفى من الكيس إلى أنبوب طرد مركزي صغير.
جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 900 مرة G لمدة دقيقة واحدة. ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. الطرد المركزي العينة عند 16 ، 000 مرة G لمدة دقيقتين.
وللتخلص من المادة الطافية ، قم بتعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من كاشف تحضير العينة وتسخينها عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في كتلة حرارية جافة. ثم قم بتبريد العينة إلى درجة حرارة الغرفة وتخزينها عند سالب 20 درجة مئوية. النوع الثاني من العينات لمقايسة LAMP يأتي مباشرة من مزارع السالمونيلا المفترضة.
لتحضير قوالب الحمض النووي ، انقل 500 ميكرولتر من مزرعة السالمونيلا الليلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق ، وقم بتسخينه في كتلة حرارية 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم قم بتبريد العينة إلى درجة حرارة الغرفة وتخزينها عند سالب 20 درجة مئوية. لمنع التلوث المتبادل ، افصل فعليا المناطق المستخدمة لإعداد LAMP Master Mix وإضافة قوالب الحمض النووي.
نظف أسطح العمل باستخدام الأيزوبروبانول ومحلول الحمض النووي والحمض النووي المدهن. بعد ذلك، نظف الماصات وحاملات شريط الأنبوب. قم بإذابة مزيج رئيسي متساوي الحرارة ، ومزيج التمهيدي 10X ، والماء من الدرجة الجزيئية ، والحمض النووي للتحكم الإيجابي ، وقوالب الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة.
قم بتشغيل أداة LAMP ، وأدخل معلومات العينة ذات الصلة. قم بإعداد LAMP Master Mix وفقا لتوجيهات المخطوطة ، وقم بدوامة وطرد مركزي لفترة وجيزة ، وقم بتوزيع 23 ميكرولترا من Master Mix في كل بئر من شريط أنبوبي. دوامة جميع قوالب الحمض النووي والطرد المركزي لها لفترة وجيزة.
بعد ذلك ، أضف ميكرولترين من قالب الحمض النووي إلى البئر المناسب ، وقم بتغطية البئر بإحكام. قم بإزالة شريط الأنبوب من الحامل ، وقم بنقره للتأكد من أن جميع الكواشف قد تجمعت في الجزء السفلي من الأنبوب. قم بتحميل شريط الأنبوب في أداة LAMP ، وابدأ تشغيل LAMP
أثناء تقدم تفاعل LAMP ، انقر فوق علامات التبويب درجة الحرارة والتضخيم والتلدين لرؤية التغييرات الديناميكية للمعلمات المختلفة أثناء تشغيل LAMP . يمكن عرض نتائج LAMP على لوحة عدادات LAMP في الوقت الفعلي ، أو باستخدام برنامج LAMP لتفسير النتائج على لوحة العدادات، افتح تشغيل LAMP الفائد.
راقب علامات التبويب الخمس المرتبطة بكل تشغيل. تظهر علامتا التبويب الملف الشخصي ودرجة الحرارة درجات الحرارة المبرمجة والفعلية في آبار العينة مع استمرار تفاعل LAMP تظهر علامات تبويب التضخيم والتلدين قراءات مضان وتغيرات في التألق أثناء مرحلتي التضخيم والتلدين على التوالي.
تعرض علامة التبويب "النتائج" العرض الجدولي لنتائج LAMP التي يمكن تفسيرها وفقا لتوجيهات المخطوطات. الطريقة الثانية لعرض نتائج LAMP هي استخدام برنامج LAMP لتفسير النتائج باستخدام البرنامج ، انقر فوق رمز الكمبيوتر على اللوحة اليسرى وانتقل إلى موقع الملف لتحميل تشغيل LAMP ذي الاهتمام.
راقب علامات التبويب السبع المرتبطة بكل تشغيل. تظهر علامتا التبويب الملف الشخصي ودرجة الحرارة درجات الحرارة المبرمجة والفعلية في آبار العينة مع استمرار تفاعل LAMP تظهر علامات تبويب معدل التضخيم والتضخيم قراءات التألق والتغيرات في التألق أثناء مرحلة التضخيم.
تظهر علامات التبويب التلدين والمشتق الصلب قراءات التألق والتغيرات في التألق خلال مرحلة التلدين. تعرض علامة التبويب النتائج عرضا جدوليا لنتائج LAMP هناك أربعة أعمدة بعنوان اسم الرسم البياني ورقم البئر واسم البئر وقيمة الذروة.
يتم عرض وقت الأمبير والمشتقات الصلبة لجميع العينات الثمانية. يمكن تفسير النتائج وفقا لتوجيهات المخطوطات. يمكن استخدام لوحة العدادات LAMP وبرنامج LAMP لعرض نتائج الفحص.
في تشغيل LAMP هذا ، العينات من S1 إلى S6 عبارة عن تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف من السالمونيلا المعوية المصلية Infantis ATCC 51741 ، تتراوح من 1.1 مليون إلى 11 وحدة تشكيل مستعمرة لكل تفاعل. التحكم الإيجابي ، أو الكمبيوتر الشخصي ، هو السالمونيلا المعوية Serovar Typhimurium LT2 عند 17 ، 000 وحدة تشكيل مستعمرة لكل تفاعل ، وعدم وجود عنصر تحكم في القالب ، أو NTC ، هو ماء من الدرجة الجزيئية. يحتوي بئر NTC على Tmax فارغ ودرجة حرارة Aneal تبلغ حوالي 81 درجة مئوية على لوحة عدادات LAMP ، و Tmax فارغة ودرجة حرارة صلب فارغة في برنامج LAMP
يحتوي بئر التحكم الإيجابي على Tmax من سبع دقائق و 45 ثانية ودرجة حرارة التلدين حوالي 90 درجة مئوية على كلا المنصتين. العينات من S1 إلى S6 لها Tmax بين ست دقائق و 30 ثانية و 12 دقيقة و 15 ثانية ، ودرجة حرارة التلدين حوالي 90 درجة مئوية ، وكلها تشير إلى اكتشاف إيجابي. LAMP فعال للغاية ويولد كمية كبيرة من الحمض النووي.
لذلك من الأهمية بمكان استخدام أفضل الممارسات المختبرية لمنع انتقال التلوث. استخدم ممارسات مماثلة عند صنع قوالب الحمض النووي الخاصة بك ، حيث يمكن أن تحتوي الإثراء من أغذية الملوثة على مستويات عالية من السالمونيلا. يجب تأكيد فحص عينة الأغذية الحيوانية الإيجابية باستخدام LAMP عن طريق عزل المزرعة باتباع الإجراءات الواردة في الدليل التحليلي البكتريولوجي الصادر عن إدارة الغذاء والدواء.
يمكن الإبلاغ عن العينات السلبية على هذا النحو. إن دمج طريقة LAMP هذه في الدليل التحليلي البكتريولوجي الصادر عن إدارة الغذاء والدواء يمهد لتطبيق أوسع لهذه التكنولوجيا السريعة والقوية وسهلة الاستخدام في اختبار سلامة الأغذية.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولًا مُعتمدًا لتضخيم متماثل الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) للكشف السريع عن السالمونيلا في أغذية الحيوانات. توفر هذه الطريقة مزايا على طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدية، بما في ذلك نتائج أسرع ومعدلات منخفضة للنتائج السلبية الكاذبة، مما يجعلها أداة موثوقة لتحديد التلوث المحتمل.
مكونات الدراسة الرئيسية
منطقة البحث
- كشف العامل الممرض
- تضخيم الحمض النووي
- سلامة الأغذية
الخلفية
- أهمية الكشف السريع عن العوامل الممرضة في المنتجات الغذائية
- الحاجة إلى طرق فحص موثوقة للسالمونيلا
- قيود طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدية
الطرق المستخدمة
- تضخيم متماثل الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP)
- السالمونيلا spp.
- استخدام بروتوكولات محددة لتحضير الحمض النووي
النتائج الرئيسية
- أثبتت فعالية LAMP في كشف السالمونيلا
- أبرزت انخفاض معدل النتائج السلبية الكاذبة لهذه الطريقة
- التحقق من الصحة من خلال المقارنة بين عدة مختبرات
الاستنتاجات
- تثبت الدراسة أن LAMP طريقة صالحة لفحص وتأكيد السالمونيلا في المنتجات الغذائية.
- تشدد على أهمية الاختبار السريع لتعزيز سلامة الأغذية ومنع المخاطر الصحية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Rapid pathogen detection in animal food is critical for preventing contamination events that could impact both animal and human health. The LAMP method provides a reliable, inhibitor-tolerant nucleic acid test that supports timely screening and confirmation workflows in food safety testing. Its incorporation into the FDA BAM underscores its value as a standardized, deployable tool for biopharma and food safety laboratories seeking to reduce false negatives and accelerate decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of Salmonella presence in complex matrices like animal food enrichments.
- Operational Value: Supports rapid hypothesis testing of contamination risk without requiring culturing timelines.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts for real-time monitoring of amplification kinetics.
- Operational Value: Delivers results in as little as 5 minutes with tolerance to inhibitors commonly found in food or culture samples.
- Strategic Value: Facilitates high-throughput screening readiness due to simple instrumentation and minimal hands-on time.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Confirms presumptive isolates from culture, bridging phenotypic and genotypic detection methods.
- Operational Value: Uses standardized DNA preparation protocols applicable to both food enrichment broths and pure cultures.
Pipeline & Workflow Integration
The LAMP method fits within food safety testing workflows as a rapid screening tool followed by culture-based confirmation when positive, supporting a tiered testing strategy.
- Discovery Biology: Enables early detection of Salmonella in pre-enriched animal food samples to inform hazard assessment.
- Screening: Provides inhibitor-resistant amplification suitable for complex food matrices after enrichment.
- Analytics: Delivers real-time fluorescence data with defined Tmax and annealing temperature thresholds for result interpretation.
- Translational Research: Confirms LAMP-positive results via culture isolation, ensuring continuity between molecular and phenotypic validation.
- Enterprise Reuse: Compatible with existing LAMP instruments and software, allowing reuse across multiple sample types and laboratories.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High specificity via invA gene targeting reduces false positives in pathogen detection.
- Operational Value: Simple workflow with minimal equipment needs (heat block, centrifuge, LAMP instrument) increases accessibility.
- Strategic Value: Low false-negative rate improves confidence in negative results, supporting release decisions.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of samples for further testing, optimizing resource use in safety programs.
Implementation Considerations
- Requires training in aseptic sample preparation and DNA template generation from enrichment broths or cultures.
- Needs access to a LAMP-capable fluorometer or real-time isothermal amplification instrument.
- Demands standardized reagent handling, including primer mixes and master mix preparation per manufacturer guidelines.
- Requires physical separation of master mix preparation and template addition zones to prevent amplicon contamination.
- Relies on proper cold storage (-20°C) of prepared DNA templates to maintain integrity between extraction and amplification.
