إعداد استخراج البروتين و إعادة التأهيل المناعي المشترك من الإيغانات Caenorhabditis

يوفر هذا البروتوكول إجراء خطوة بخطوة لجمع العينات وإعداد الاستخراج والترسيب المناعي لتأكيد سحب البروتين الناجح والكشف عن البروتينات المترسبة المناعية المشتركة ذات الأهمية. يمكن إجراء تحضير مستخلص البروتين لما يصل إلى 24 عينة وهو متوافق مع عدد من التطبيقات النهائية ، بما في ذلك الترسيب المناعي وتجارب الحمض النووي الريبي المنسدل. يمكن تكييف هذه الطريقة لتسهيل اختبار التفاعلات بين اثنين أو أكثر من بروتينات C.elegans الداخلية أو الموسومة داخليا أو المعبر عنها بشكل مفرط في مجموعة متنوعة من الخلفيات الجينية.

يهدف العرض المرئي لهذا البروتوكول إلى جعل الباحثين مرتاحين لتحضير مستخلص البروتين والترسيب المناعي ، ونأمل أن نشجع أولئك الجدد على التقنيات على استخدامها في أبحاثهم. لجمع عينة من الدودة ، قم بخلط البذور الأولى في المرحلة أو الديدان المتزامنة على صفائح متوسطة نمو الديدان الخيطية الصلبة عند درجة الحرارة المطلوبة والسماح للديدان بالنمو حتى المرحلة المطلوبة. في نهاية الحضانة ، استخدم المخزن المؤقت M9 لغسل الديدان في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وحبيبات الديدان عن طريق الطرد المركزي.

في نهاية الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية واغسل الديدان ثلاث إلى خمس مرات إضافية في مخزن M9 الطازج لكل غسلة. عندما لا يكون المادة الطافية غائمة ، قم بإجراء غسيل أخير بالماء المقطر المزدوج وانقل حبيبات الدودة السائبة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. قم بتكسير الديدان باستخدام طرد مركزي إضافي وتخلص من المادة الطافية المتبقية للحصول على حبيبات دودة معبأة.

لتحضير مستخلص من حبيبات الدودة التي تم جمعها ، أضف حجما متساويا من محلول التحلل المثلج البارد 2X إلى حبيبات حجم 300 ميكرولتر موصى بها واخلط التعليق الناتج بقوة. قم بتدوير العينة لتجميع الخليط في قاع الأنبوب ونقل محتويات الأنبوب إلى أنبوب خال من الحمض النووي الريبي سعة 1.5 مليلتر يحتوي على حبات معدنية. بعد تغطية الأنبوب بإحكام ، ضع العينة في الخالط مطحنة الخرز عند أربع درجات مئوية مع الحرص على أن تكون العينة متوازنة داخل الخالط.

قم بتجانس العينة بأعلى سرعة لمدة أربع دقائق قبل نقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مليلتر بدون خرز. قم بتدوير العينة لتوضيح مستخلص البروتين ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل على الجليد دون نقل الراسب الأبيض الغائم في الجزء العلوي من العينة. ضع جانبا 10 ميكرولترات من المستخلص المصفى لتحديد إجمالي تركيز البروتين وفقا للبروتوكولات القياسية وقم بتخفيف العينة على الفور إلى خمسة أو 10 ملليغرام من البروتين لكل مليلتر من محلول التحلل المثلج البارد 1X على الجليد.

من أجل الترسيب المناعي للبروتين محل الاهتمام ، قم أولا بتعليق الخرزات المغناطيسية عن طريق الانعكاس ونقل 150 ميكرولترا من تعليق حبة 50X إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. قم بمغنطة الخرز على الجليد مقابل حامل مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة تقريبا. عندما يكون المحلول واضحا ، تخلص من المادة الطافية.

قم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي واغسل الخرزات بثلاثة أحجام 300 ميكرولتر من عازلة التحلل 1X. بعد الغسيل الأخير ، قم بتعليق الخرزات في 150 ميكرولتر من محلول التحلل المثلج البارد وانقل 75 ميكرولترا من ملاط الخرزة إلى ملليغرامين من عينة مستخلص البروتين. بعد حضانة لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية مع تحريك لطيف ، ضع أنبوب العينة في المغناطيس على الجليد لمدة دقيقة واحدة تقريبا.

عندما تكون الخرزات ممغنطة بالكامل وتكون العينة واضحة ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر دون إزعاج الخرز. خصص 10٪ من العينة لتحليل اللطخة الغربية وأضف 20 ميكروغراما من الجسم المضاد المنقى التقارب إلى المحللة التي تم تطهيرها مسبقا لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية مع تحريك لطيف. في نهاية الحضانة ، أضف 75 ميكرولترا المتبقية من معلق الخرزة المغسول مسبقا إلى خليط محللة الجسم المضاد للحصول على حضانة إضافية لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية مع تحريض لطيف.

في نهاية الحضانة ، ضع العينة مرة أخرى على المغناطيس لمدة دقيقة واحدة تقريبا. عندما تكون الخرزات ممغنطة بالكامل وتكون العينة واضحة ، اغسل الخرزات التي تحتوي على الراسب المناعي ثلاث مرات في 450 ميكرولتر من محلول الغسيل على الجليد. بعد الغسيل الأخير ، قم بتعليق حبيبات الخرزة في 20 ميكرولتر من 2X SDS بيتا ميركابتو إيثانول بروتين تحميل هلام المخزن المؤقت وغلي العينة على 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

للكشف عن البروتينات المترسبة المناعية عن طريق تحليل اللطخة الغربية ، قم بتحميل عينة البروتين المشوهة على جل SDS-PAGE دون نقل الخرزات وإجراء تحليل اللطخة الغربية وفقا للبروتوكولات القياسية باستخدام الأجسام المضادة المناسبة للبروتينات ذات الأهمية ، ثم اكتشف العصابات باستخدام التلألؤ الكيميائي القائم على بيروكسيداز الفجل. يمكن مقارنة بروتوكول الخالط المطحنة المثبت في استخراج البروتين الكلي بالطرق القائمة على الهبوط للاستخراج الفعال للبروتينات النووية والسيتوبلازمية. في هذا التحليل ، تم تحديد بروتينات Argonaute للتفاعل مع أعضاء عائلة البروتين GW182 التي تشكل مجمعات الإسكات التي يسببها الحمض النووي الريبي الميكروي والتي ترتبط بالحمض النووي الريبي المرسال المستهدف وتقمع تعبيرها.

يمكن أيضا استخدام بروتوكولات المستخلص والترسيب المناعي المثبتة لاستعادة الرواسب المناعية المشتركة الخاصة ب ALG-1 و HRPK-1 بنجاح. بالإضافة إلى ذلك ، كشف اختبار تفاعل ALG-1: AIN-1 في مجموعة متنوعة من الخلفيات الجينية أن HRPK-1 غير ضروري لتجميع مجمع الإسكات الناجم عن الحمض النووي الريبي الميكرو ALG-1: AIN-1. من المهم التأكد من إجراء استخراج البروتين والترسيب المناعي عند أربع درجات مئوية أو على الجليد للحفاظ على استقرار العينات.

يتوافق مستحضر مستخلص البروتين الكلي هذا مع الترسيب المناعي للبروتين وتجارب السحب من الحمض النووي الريبي الصغير باستخدام قليل النوكليوتيد المجاني للحمض النووي الريبي الصغير ويسهل الجمع النهائي لكل من مكونات البروتين والحمض النووي الريبي.