إعداد الأنسجة القلبية المهندسة على شكل شبكة مشتقة من خلايا iPS البشرية لإصلاح عضلة القلب في فيفو
يونيو 9, 2020
يولد هذا البروتوكول أنسجة قلبية هندسية على شكل شبكة تحتوي على خلايا القلب والأوعية الدموية المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان للسماح بالتحري عن علاج زرع الخلايا لأمراض القلب.
يصف هذا البروتوكول طريقة نبيلة وسهلة لإنشاء أنسجة قلبية هندسية على شكل شبكة مشتقة من أجزاء الجسم المستحثة البشرية وخلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية. المرونة في هندسة الأنسجة وقابلية توسعية وظيفة الأنسجة المحفوظة هي المزايا الرئيسية لهذه التقنية. يمكن لـ ECTs شكل الشبكة المزروع استعادة بنية القلب ووظيفته في نموذج احتشاء عضلة القلب الفئران.
التأكد من جدواها للاستخدام في العلاج التجديدي القلبي. تتطلب هذه التقنيات معالجة خلايا STEM البشرية القابلة للتكرار ومهارات زراعة الأنسجة لتحقيق نتائج متسقة. تبدأ بقطع ورقة PDMS الشفاء إلى الحجم المناسب للسماح ورقة لتكون مستعبدة مع لاصق سيليكون لتصنيع 21 في 20.5 ملليمتر علبة مستطيلة مع سبعة ملليمتر طويلة 0.5 ملليمتر واسعة و 2.5 ملليمتر وظائف مستطيلة عالية في وضعية متداخلة.
يجب أن يكون التباعد الأفقي بين خطين من الوظائف 2.5 ملليمتر. اُمَكف الصلبة بـ 120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة قبل طلاء القالب بـ 1٪ Poloxamer 407 في PBS لمدة ساعة واحدة. ثم شطف جيدا القالب مع برنامج تلفزيوني ووضع القالب في بئر واحد من لوحة ستة جيدا.
لتحليل النسب، والجمع بين الخلايا من القلب بالإضافة إلى البروتوكولات الخلايا جدارية البطانية والأوعية الدموية. بحيث يكون التركيز النهائي للخلايا الجدارية 10 إلى 20٪ في عدد الخلايا الإجمالية من ست مرات 10 إلى الخلايا الست لكل بناء. مزيج 133 ميكرولترات من حمض قابل للذوبان الجرذان الكولاجين نوع واحد حل و 17 ميكرولترات من العازلة القلوية إلى 17 ميكرولترات من 10X الحد الأدنى المتوسطة الأساسية على الجليد.
ثم إضافة 67 ميكرولترات من مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى حل الكولاجين. المقبل، الطرد المركزي الخلايا وإعادة تعليق بيليه في 167 ميكرولترات من ارتفاع الجلوكوز دوليبيككو الحد الأدنى الأساسية المتوسطة تكملها مصل البقر الجنين والمضادات الحيوية. خلط الخلايا على حل المصفوفة على الجليد.
ثم صب بعناية 400 ميكرولترات من تعليق مصفوفة الخلية على بولوإكسامر 407 المغلفة PDMS العفن الأنسجة. احتضان خليط مصفوفة الخلية في حاضنة ثقافة الخلايا القياسية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 60 دقيقة. عندما تكون الأنسجة قد تشكلت، نقع بعناية العفن مع أربعة ملليلتر من ECT ثقافة المتوسطة والعودة لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 14 يوما.
قبل زرع العلاج بالصدمات الكهربائية، قمت بتعقيم ملقط غرامة لإزالة بعناية العلاج بالصدمات الكهربائية من وظائف التحميل. يمكن أن تكون ملفقة قوالب الأنسجة مع أنماط مختلفة، وأطوال آخر والتباعد ما بعد لتوليد هندسة العلاج بالصدمات الكهربائية النهائي مختلفة. لهذا التحليل، تم استخدام قالب مع سبعة وظائف ملليمتر طويلة مع 2.5 ملليمتر فواصل واسعة.
Poloxamer 407 يمنع التصاق الخلايا بالعفن وتمكن من تشكيل بنية شبكة مميزة ، بعد ضغط هلام سريع في 14 يومًا. يتم الحفاظ على هيكل حتى بعد تحرير العلاج بالصدمات الكهربائية من القالب. بناء الأنسجة المفبركة هو ما يقرب من 1.5 سم واسعة و 0.5 ملليمتر سميكة.
وعرض كل حزمة في شبكة هو ما يقرب من 0.5 ملليمتر في المتوسط. فمن الممكن لتوليد 3 سم النهائي عرض شبكة ECT التي تحتوي على 24 مليون خلية من العفن أربع مرات أكبر مع نفس متداخلة آخر التصميم. ويمكن أيضا أن هذا أكبر شبكة العلاج بالصدمات الكهربائية يمكن إزالتها بسهولة من القالب ويولد فعل المحلية للقوة ما يعادل أصغر ECT شبكة.
من المهم صب خليط مصفوفة الخلية بالتساوي في قالب الأنسجة دون توليد فقاعات لمنع عيوب الشعور في الجل النهائي. توصيف وظيفي للمتعاقد. ويمكن تنفيذ علاقات التردد الرابعة باستخدام أنظمة مدمجة.
هدفنا النهائي هو ترجمة نماذج العلاج بالصدمات الكهربائية إلى علاجات سريرية تستخدم دراسات حيوانية كبيرة قبل السريرية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة وسهلة لإنشاء أنسجة قلبية مهندسة على شكل شبكة مشتقة من خلايا جذعية بشرية مستحثة متعددة القدرات. تتيح هذه التقنية دراسة علاج زرع الخلايا لأمراض القلب، وبشكل خاص في نموذج احتشاء عضلة القلب لدى الجرذان.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- هندسة الأنسجة القلبية
- العلاج بالخلايا الجذعية
- الطب التجديدي
خلفية علمية
- يمكن للأنسجة القلبية المهندسة أن تستعيد بنية القلب ووظيفته.
- تُعد الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات مورداً قيماً لاشتقاق الخلايا القلبية.
- تعتبر مرونة هندسة الأنسجة أمراً بالغ الأهمية لضمان فعالية الزرع.
- تعد القابلية للتكرار في معالجة الخلايا الجذعية ضرورية لتحقيق نتائج متسقة.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة لإنشاء أنسجة قلبية هندسية على شكل شبكة.
- تقييم جدوى هذه الأنسجة في علاج تجديد القلب.
- استقصاء استعادة الوظائف القلبية بعد الزرع.
الطرق المستخدمة
- تصنيع صينية مستطيلة الشكل باستخدام PDMS واللاصق السيليكوني.
- إنشاء دعامات لدعم الأنسجة المهندسة.
- زراعة الأنسجة القلبية المهندسة في نموذج جرذ.
- تقييم استعادة بنية ووظيفة القلب.
النتائج الرئيسية
- نجحت الأنسجة القلبية المهندسة ذات الشكل الشبكي في استعادة الوظيفة القلبية.
- أثبتت الطريقة القابلية للتوسع والمرونة في هندسة الأنسجة.
- تم تحقيق نتائج متسقة من خلال معالجة الخلايا الجذعية القابلة للتكرار.
- تعد هذه التقنية مجدية للاستخدام في العلاج التجديدي للقلب.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لإنتاج أنسجة قلبية مهندسة.
- يمكن للأنسجة ذات الشكل الشبكي استعادة وظائف القلب بشكل فعال في نموذج احتشاء عضلة القلب.
- يعد هذا النهج واعداً لعلاجات تجديد القلب في المستقبل.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
يتيح هذا البروتوكول إنتاجاً قابلاً للتوسع لأنسجة قلبية هندسية على شكل شبكة من خلايا قلبية وعائية مشتقة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات (iPSC)، مما يوفر منصة قابلة للتكرار لاستراتيجيات إصلاح عضلة القلب. ويدعم هذا النهج التقييم قبل السريري لتكامل الأنسجة واستعادة الوظائف في نماذج الإصابة بنقص التروية، مما يعالج فجوة حرجة في طب القلب التجديدي. ومن خلال توفير بنية قابلة للتطوير وضبط هندسي، يسهل هذا البروتوكول تقليل المخاطر الانتقالية للعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية لفشل القلب.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال تقييم التكامل الهيكلي والوظيفي للخلايا القلبية المشتقة من hiPSC في الجسم الحي.
- القيمة التشغيلية: توفر تنسيقاً نسيجياً موحداً وقابلاً للتكرار لضمان اتساق القراءات قبل السريرية عبر الدراسات المختلفة.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توليد مقاييس هيكلية قابلة للقياس الكمي (مثل محاذاة حزم الألياف العضلية، والتقلص المتزامن) لتطوير المقاييس الوظيفية.
- القيمة التشغيلية: دعم إمكانية التوسع لبنى أكبر (تصل إلى 3.0 cm) مما يسمح باختبار الاستجابة للجرعة واتساق الدفعات.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يثبت إمكانية استعادة بنية القلب ووظيفته في نموذج احتشاء عضلة القلب في الجرذان، مما يدعم تقليل المخاطر الميكانيكية.
- القيمة التشغيلية: يربط مرحلة الاكتشاف بالتحقق قبل السريري من خلال سير عمل موحد لعمليات الزرع والتقييم الوظيفي.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تضع هذه الطريقة الأنسجة المهندسة خلوياً (ECTs) ذات الشكل الشبكي كجسر يربط بين مرحلة الاكتشاف والمرحلة قبل السريرية، مما يتيح اختبار الفرضيات في مراحل الاكتشاف المبكرة والتحقق الوظيفي في المراحل قبل السريرية من خلال إنتاج أنسجة قابلة للتطوير والتكرار.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم توضيح المسارات وتقليل المخاطر البيولوجية من خلال تمكين التقييم المنضبط لتكامل الخلايا القلبية المشتقة من hiPSC والوظيفة الكهروميكانيكية.
- الفحص: توفر أنسجة قياسية جاهزة للمقايسة بنتائج قابلة للقياس الكمي (تزامن النبض، المحاذاة) للمقارنة بين المركبات أو الظروف المختلفة.
- التحليلات: توفر قراءات بنيوية ووظيفية (أبعاد التركيب، قطر الليفة العضلية، تزامن الانقباض) لتمكين التحليل المقارن عبر المجموعات التجريبية.
- الأبحاث الانتقالية: تضمن الاستمرارية من النضج في المختبر (in vitro) إلى استعادة الوظيفة في الجسم الحي (in vivo)، مما يدعم قرارات التقدم المدروسة بناءً على تقييم المخاطر.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس تكنولوجيا منصة قابلة للتكيف مع مختلف الأشكال الهندسية والمقاييس، مما يعزز قابلية التكرار عبر المشاريع وكفاءة الموارد.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزز الثقة التنبؤية من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في تطعيم الخلايا الجذعية والمساهمة الوظيفية في إصلاح القلب.
- القيمة التشغيلية: تضمن التوحيد القياسي وقابلية التوسع من خلال تحديد نسب الخلايا، وصياغة المصفوفة، وهندسة القالب.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال توفير بيانات فعالية قبل سريرية قابلة للتكرار، مما يقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة.
- تأثير المحفظة: تتيح تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر لمرشحي تجديد القلب بناءً على أداء الأنسجة المعتمد وقابلية التوسع.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تمايز الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات (iPSC)، وتحديد السلالة القلبية الوعائية، وتقنيات زراعة الأنسجة ثلاثية الأبعاد.
- يعتمد على توفر معدات صب PDMS، وإمكانيات التعقيم، والتعامل الدقيق مع السوائل لخلط الخلايا بالمصفوفة.
- يستلزم توحيد معايير فرق العمل فيما يخص مصادر الخلايا، وتحضير المصفوفة، وبروتوكولات الحضانة لضمان الاتساق بين الدفعات.
- يتضمن اعتبارات التكييف عند التوسع في بناء هياكل أكبر أو هندسيات بديلة، خاصة فيما يتعلق بانتشار العناصر الغذائية والاقتران الكهربائي.
- يقتصر بسبب الاعتماد الحالي على نماذج القوارض للتحقق الوظيفي، مما يتطلب أنظمة سريرية مسبقة أكبر من أجل الترجمة السريرية.
