نموذج دروسوفيليا لدراسة البوليسبليد الناجم عن الجروح

يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة التعدد الناجم عن الجروح. عملية إصلاح الأنسجة المحافظة، التي تنمو الخلايا بدلا من تقسيم في ذبابة الفاكهة الكبار. يمكن إجراء جرح ثقب بسيط للحث على تعدد البوليبلويدي في ظهارة الذبابة في غضون يومين فقط.

حجم الخلايا الظهارية، ploidy والتنظيم، ويمكن بعد ذلك تقييمها بسهولة. تبدأ بجمع قنينتين، تحتوي على 10 إلى 15 الذباب الفاكهة الإناث مغلقة حديثا من سلالة من الفائدة. والشيخوخة الذباب في قوارير الطعام الطازج، مع ما يقرب من خمسة الذباب الذكور لكل قارورة في 25 درجة مئوية، حتى ثلاثة إلى خمسة أيام من العمر.

لجرح في البطن، في نهاية الحضانة، واستخدام واحد 0.1 ملليمتر غير القابل للصدأ دبوس الصلب لتجميع العديد من أصحاب دبوس، مع نهاية حادة من كل دبوس سرعة الخروج. تخدير ذباب الفاكهة الإناث المسنين على منصة ذبابة ثاني أكسيد الكربون تحت مجهر ستيريو. واستخدم فرشاة طلاء لترتيب الذباب في صف واحد.

ارتداء نظارات السلامة، مع حامل دبوس في يد واحدة والملباب في جهة أخرى، واستخدام ملقط لوضع الذباب مع البطن البطنية التي تواجهها. ثم ثقب الذباب الإناث الكبار داخل المنطقة اليمنى الزرقاء الظهارية من الهدف A4 على جانبي الليالي يحرك خط الوسط البطني وإعادة الذباب الجرحى إلى قارورة الطعام حتى نقطة الوقت التجريبية المطلوبة بعد الإصابة. في نقطة النهاية التجريبية، تحقق من وجود الجرح والندبة في كل ذبابة تخدير تحت المجهر ستيريو وملء بئر واحد من تسعة طبق تشريح الزجاج جيدا مع حل غريس.

باستخدام زوج من ملقط، فهم ذبابة أنثى الجرحى من الجانب الظهري من الصدر وغمر الذبابة في بئر الحل. مع ناحية أخرى، استخدم زوج الثاني من ملقط لثقب وإزالة بشرة الظهرية أدناه الهدف A6، في الجزء الخلفي من ذبابة الفاكهة. إذا لم يتم استخراج الأعضاء الداخلية ، قم بالضغط على الجانب الظهري من البطن للضغط على الأعضاء المتبقية.

استخدام ملقط لالانجذاب قبالة البطن الكامل عند تقاطع الصدر فوق الهدف A2 ونقل البطن إلى بئر تحتوي على ما يقرب من 100 ميكرولترات من محلول غريس. عندما تم جمع جميع البطن، والحد من حجم حل غريس في جمع جيدا إلى 30 ميكرولترات. استخدام ملقط في يد واحدة لعقد الجانب الظهري في البطن لأسفل واستخدام اليد الأخرى لإدراج شفرة أسفل مقص الربيع البندقية في تجويف البطن من كل البطن وقطع على طول خط الوسط الظهري حتى البطن مفتوحة تماما.

إضافة 30 ميكرولترات من حل غريس في كل منطقة تصاعد من لوحة تشريح الجافة مع دبابيس 4.1 ملليمتر في منطقة تصاعد البطن ووضع فيليسيد البطن في قطرة من الحل. عندما تم فيليه كل من البطن وضعت، دبوس البطن إلى الطبق على الزوايا الظهرية الأربعة. الحرص على أن الأنسجة هي مسطحة الكذب دون تمزق أو الإفراط في تمدد أنسجة البطن.

ثم استبدال حل غريس مع 30 ميكروليتر حل المثبت لكل منطقة التركيب. ووضع علامة الشريط على الجزء السفلي من كل طبق للاحتفال كل مجموعة التحكم والتجريبية. لتركيب عينات أنسجة الذباب.

بعد تلطيخ، واستخدام ملقط لفك البطن من لوحة تشريح تحت المجهر ستيريو. واستخدام ملقط لنقل كل عينة من جانبها الظهرية إلى ما يقرب من 30 ميكرولترات من المتوسطة المتصاعدة على زلات الغطاء الزجاجي الفردية. تحت المجهر ستيريو توجيه أنسجة البطن بحيث يكون في الداخل تواجه لأسفل نحو زلة الغطاء واستخدام ملقط لسحب البطن المنحى إلى حافة كل قطرة وسائل الإعلام.

ضع كل زلة غطاء محمول على شريحة زجاجية تحملها. واستخدام نسيج مختبر لإزالة أي زيادة في تركيب المتوسطة. ثم ختم حواف زلة الغطاء مع طلاء الأظافر واضحة وتخزين الشرائح في مربع الشريحة في أربع درجات مئوية حتى التصوير.

وسبتات وصلة البروتين السريع ثلاثة التي تسميات الخلية وصلات الخلية، ويوفر مؤشرا على ما إذا كان أي الانزعاجات المعالجة وقعت أثناء التحضير. البطن مع خدوش كبيرة من المنطقة غير المطّطّة التي تُجَبّر منطقة الجرح، يجب التخلص منها وعدم تضمينها في التحليل. اكتمال إصلاح الجروح عندما تغطي خلية مركزية كبيرة متعددة النوى الجرح.

وتعتبر الثغرات التي تزيد عن 10 ميكرومترات على الورقة الظهارية عيوباً في إغلاق الجروح وإعادة الظهارة. في هذا التحليل التمثيلي باستخدام الذباب مع تنشيط الخلية الميتوليتية المثبطة ، 52 ٪ من الجروح لم تتمكن من تشكيل ورقة ظهارية مستمرة على الجرح. هذا الغشاء الجرح الشفاء مقال يوفر المزيد من المعلومات إلى حد عيب إصلاح الجرح السماح إعادة الظهارة العيوب التي يمكن تجميعها إما مفتوحة تماما ، مغلقة جزئيا أو مغلقة تماما.

على سبيل المثال، في هذه التجربة تثبيط من المضاعفة الناجمة عن الجروح عن طريق منع المتزامنة من النسخ المتماثل الإندو والانصهار الخلية، تسبب في 92٪ من الجروح الظهارية لتبقى مفتوحة تماما. في حين أدى تنشيط دورة الخلية الميتاستيك في عيب إغلاق الجرح الظهارية. وبالإضافة إلى ذلك، تم الكشف عن نشاط دورة الخلية عن طريق دمج thymidine التناظرية EDU وتم تحديد ploidy الظهارية عن طريق قياس محتوى الحمض النووي مباشرة.

عند تشريح ظهارة البطن، الحرص على عدم لمس الأنسجة مع أي من أدوات disecting لأن هذا سوف يخدش العينة. بعد تشريح, يمكن إجراء انتشار الخلايا, موت الخلية, حجم شق فقدان الخلية أو تقييمات محتوى الحمض النووي DNA لتحسين فهم التكاثر الناجم عن الجروح. أو غيرها من العمليات داخل ظهارة.