مواصفات السلف الكبدي من الخلايا الجذعية متعددة القدرات باستخدام نظام تمييز محدد

يوفر هذا البروتوكول نظام تمايز كبدي مشتق من الخلايا الجذعية يوفر أداة قابلة للتكرار لدراسة بيولوجيا الكبد لكل من البحوث الأساسية والسريرية. من خلال الجمع بين بروتوكول موحد وسهل المتابعة مع كواشف الاستزراع الجاهزة ، يسمح هذا النظام بإنتاج أسلاف كبدية وخلايا شبيهة بخلايا الكبد على نطاق واسع. الحفاظ على الخلايا البشرية متعددة القدرات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في طبق 10 سم على laminin-531 ، وإطعامها يوميا ب 10 ملليلتر من وسط صيانة الخلايا الجذعية لكل طبق.

لتحضير اللامينين 521 لوحا ، قم بتخفيف اللامينين المذاب 521 في DPBS المثلج البارد مع الكالسيوم والمغنيسيوم إلى تركيز نهائي يبلغ ثمانية ميكروغرام لكل مليلتر. أضف 250 ميكرولترا من محلول اللامينين إلى كل بئر من 24 بئرا أو 50 ميكرولترا إلى كل بئر من لوح 96 بئرا. قم بهز اللوحة برفق من جانب إلى آخر لتغطية الآبار بالتساوي ، ثم أغلق الألواح بغشاء مرن شبه شفاف وقم بتخزينها عند أربع درجات مئوية طوال الليل.

في يوم بذر الخلايا ، قم بتسخين الألواح المطلية مسبقا في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 30 إلى 60 دقيقة. قم بشفط محلول laminin 521 وأضف وسيط صيانة الخلايا الجذعية المكمل بمثبطات ROCK 10 micromolar إلى كل بئر ، ثم أعد اللوحة إلى الحاضنة. عندما تصل طلاقة عدد الخلايا إلى 70 إلى 80٪ ، قم بشفط الوسط المستهلك من طبق الثقافة واغسل كل طبق مزرعة بخمسة ملليلتر من DPBS بدون كالسيوم أو مغنيسيوم في درجة حرارة الغرفة.

قم بشفط غسل DPBS من طبق المزرعة ، ثم أضف خمسة ملليلتر من كاشف التفكك الخالي من الإنزيم إلى الطبق واحتضان الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة ثماني إلى 10 دقائق حتى تنفصل الخلايا بشكل واضح عن الطبق. افصل الخلايا برفق عن طبق الاستزراع باستخدام مكشطة خلية، ثم قم بسحب محتويات كل بئر لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلتر للحصول على معلق خلية واحدة. لكل خط خلية ، تجمع الخلايا من جميع آبار الصيانة في أنبوب معقم سعة 50 مل.

اغسل كل طبق مزرعة مفرغ بخمسة ملليلتر من وسط صيانة الخلايا الجذعية هذه وأضف الغسالات إلى الأنبوب المقابل بالخلايا المجمعة. قم بإجراء ثلاث عمليات عد خلايا قابلة للتطبيق على كل عينة مجمعة. الطرد المركزي للعينات المجمعة عند 250 × جم لمدة خمس دقائق.

ثم استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في واحد إلى ثلاثة ملليلتر من درجة حرارة الغرفة كوسيط صيانة للخلايا الجذعية مكمل بمثبط 10 ميكرومولار ROCK Y27632. بعد حساب العدد المطلوب من الخلايا اللازمة لتحقيق كثافة البذر المطلوبة ، قم بإعادة تعليق الخلايا إلى التركيز المناسب وتوزيعها في الألواح المطلية مسبقا. يجب أن يكون الحجم الإجمالي لكل بئر ملليلتر واحد للوحة 24 بئرا و 0.1 مليلتر للوحة 96 بئرا.

قم بهز الألواح برفق من جانب إلى آخر وذهابا وإيابا لضمان تشتت الخلايا بشكل متساو وضع الألواح المصنفة في الحاضنة ، وهزها ذهابا وإيابا ومن جانب إلى آخر. إعداد الوسائط لتحريض الأديم الباطن النهائي ولتمايز مواصفات الخلية السلفية الكبدية اللاحقة كما هو موضح في المخطوطة النصية. في اليوم الأول من التمايز ، قم بإزالة الوسط المستهلك من الآبار واستبدله بالمرحلة الأولى متوسطة.

في الأيام الثانية والثالثة والرابعة ، قم بإزالة الوسط المستهلك وقم بإطعام كل بئر بالمرحلة الأولى المتوسطة الثانية. في اليوم الخامس ، قم بإصلاح الآبار المخصصة لتحليل تمايز الأديم الباطن النهائي. بالنسبة للآبار المتبقية ، قم بإزالة الوسط المستهلك وتغذية كل بئر بوسط سلف كبدي مختلف الجذعية.

في اليوم 10 ، قم بحصاد الخلايا لتحليل تمايز السلف الكبدي أو المضي قدما في مزيد من خلايا الكبد مثل تمايز الخلايا. لتوصيف ثقافات تمايز السلف الكبدي ، استخدم التلوين المناعي للكشف عن التعبير عن علامات الأديم الباطن النهائية في اليوم الخامس والعلامات المحددة للسلف الكبدي في اليوم 10 وتحديد النسبة المئوية لخلايا HNF4 إيجابية ألفا. في اليوم 10 ، قم أيضا بقياس إفراز بروتين ألفا والألبومين عبر ELISA.

تم استخدام هذا البروتوكول للتمييز بين الخلايا السلفية الكبدية من كل من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان. في اليوم الخامس من بروتوكول التمايز ، تم تقييم مواصفات الأديم الباطن النهائية عبر تعبير Sox 17. في كلا خطي الخلايا ، تم التعبير عن Sox 17 بشكل كبير مع 80 و 87.8٪ من خلايا Sox 17 الموجبة ل H9 و P106 ، على التوالي.

في اليوم العاشر ، أظهر أسلاف الكبد مورفولوجيا تشبه الحصى. بالإضافة إلى ذلك ، تم تقييم مواصفات السلف الكبدي لتعبير HNF4 alpha و AFP و albumin و cytokeratin 19. عبرت كلتا المزارعين السلفية الكبدية عن علامات كبد جنينية ، مثل HNF4 alpha و AFP و CK 19.

تم الكشف عن إفراز بروتين ألفا الجنيني في اليوم 10 في كلا خطي الخلايا بينما لم يتم اكتشاف إفراز الألبومين باستخدام ELISA. تم تقييم تقلب عدد الخلايا وكفاءة تمايز السلف الكبدي عن طريق تحديد تعبير ألفا HNF4. في اليوم 10 ، لم تظهر أسلاف الكبد أي تباين كبير عبر الصفوف مع أكثر من 95 و 97٪ من خلايا ألفا إيجابية HNF4 لكل بئر ل H9 و P106 ، على التوالي.

التوزيع المتساوي للخلايا قبل بدء التمايز أمرا أساسيا لضمان وجود مجموعة متجانسة من الخلايا السلفية الكبدية. لتحقيق ذلك ، قم بهز الألواح برفق جنبا إلى جنب وذهابا وإيابا لضمان تشتت الخلايا بشكل متساو. يمكن تمييز الخلايا السلفية الكبدية التي ينتجها هذا البروتوكول إلى خلايا شبيهة بخلايا الكبد لإجراء فحوصات أخرى ، مما يوفر أداة قابلة للتكرار وموحدة لنمذجة المرض أو فحص الأدوية.