Name: مُقَسَم غير كهربي لقياس فوسفورية البولي نووكليوتيد من ركائز النيوكليوتيدات الصغيرة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: تعلم قياس نشاط كيناز البولي نووكليوتيدات على ركائز DNA وRNA الصغيرة بطريقة غير كهربية. تكشف هذه التقنية عن تغيرات صغيرة في الفوسفوريلة عند الطرف 5' للأحماض النووية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر الدكتور أندرو سيكيما وأندريا كامينسكي على قراءتهما النقدية لهذه المخطوطة. وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني الأمريكي لبرنامج البحوث الصحية الداخلية؛ المعهد الوطني الأمريكي لعلوم الصحة البيئية (NIEHS) ZIA ES103247 إلى R.E.S) والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR; 146626 إلى M.C.P).

1- الإعداد
<ol><li>إعداد المخزن المؤقت والكواشف.<ol>
<li>جعل 1x التفاعل العازلة من خلال الجمع بين 20 ميكرولتر من 1 م تريس (درجة مئوية = 8.0)، 40 ميكرولتر من 5 م كلوريد الصوديوم، 2.5 ميكرولتر من 2 م كلوريد المغنيسيوم، 100 ميكرولتر من 50٪ (الخامس / الخامس) الجلسرين، والمياه الخالية من RNase للوصول إلى حجم إجمالي قدره 1 مل.</li>
		<li>جعل صبغة تحميل اليوريا عن طريق الجمع بين 4.8 غرام من اليوريا، 200 ميكرولتر من 1 م تريس (pH = 8.0)، 20 ميكرولتر من 0.5 M EDTA (pH = 8.0)، 0.5 مل من 1٪ (ث / الخامس) الأزرق البروموفينول، والمياه الخالية من RNase لتصل إلى حجم إجمالي قدره 10 مل.</li>
		<li>جعل 10x TBE العازلة من خلال الجمع بين 108 غرام من قاعدة تريس، 55 غرام من حمض البوريك، 40 مل من 0.5 M EDTA (درجة الحموضة = 8.0)، والمياه الخالية من RNase لتصل إلى حجم إجمالي 1 لتر.</li>
		<li>جعل 10٪ (ث / الخامس) persulfate الأمونيوم (APS). تزن 0.5 غرام من وكالة الأنباء الجزائرية وإضافة 3 مل من الماء RNase خالية من أجل حل الصلبة. إضافة مياه خالية من RNase لتصل إلى حجم إجمالي قدره 5 مل. لف الأنبوب في احباط وتخزين الحل في 4 درجة مئوية. ملاحظة: تذوب APS مع مرور الوقت. استبدال 10٪ APS الأسهم كل 2 أسابيع.</li>
	</ol>
</li>
	<li>الحصول على إنزيم كيناز متعدد النوى.<ol>
<li>الحصول على نقية Las1-Grc3 PNK انزيم2 المخزنة في التفاعل العازلة (انظر الخطوة 1.1.1) في تركيز المخزون من 20 μM. سوف تختلف المخزن المؤقت استناداً إلى PNK معينة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد الركيزة حمض نووي. ملاحظة: هذا البروتوكول يرصد 5'-الفوسفور من الركيزة RNA 27 nt التي تؤوي موقع معالجة Las1-Grc3 (موقع C2) الواردة في Saccharomyces cerevisiae قبل الريبوسوم الداخلية المناسخة 2 (SC-ITS2؛ انظر الجدول 1),25،26.2<ol>
<li>كيميائيا توليف الركيزة RNA oligonucleotide التي تحتوي على نهاية 5'-هيدروكسيل جنبا إلى جنب مع تسمية 3'-fluorescent. وسوف تستخدم الفلوروفور لتصور الجيش الملكي النيبالي. تأكد من وضع الفلوروفور على نهاية الحمض النووي الريبي التي لا تستهدف الفوسفور. كبديل للمصادر التجارية، يمكن تنفيذ وضع العلامات الفلورية الداخلية والمحطة الطرفية لركائز الحمض النووي الريبي في المنزل باستخدام بروتوكولات فعالة من حيث التكلفة27.</li>
		<li>إزالة الفلوروفور الزائدة من رد فعل الرنا وضع العلامات بواسطة HPLC تنقية28.</li>
		<li>Resuspend الحمض النووي الريبي باستخدام مياه خالية من RNase إلى 500 nM.</li>
		<li>تخزين aliquots RNA في -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل أو -20 درجة مئوية للتخزين على المدى القصير.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد سلسلة تركيز ATP.<ol>
<li>جعل 20 mM المخزون العامل من ATP باستخدام التفاعل العازلة (انظر الخطوة 1.1.1). استخدم هذا المخزون العامل لتوليد أربعة عمليات تخفيف تسلسلية تتراوح بين 20 mM-0.02 mM.</li>
		<li>لجعل التخفيف الأول من سلسلة التركيز، مزيج 1 ميكرولتر من 20 mM ATP المخزون العمل مع 9 ميكرولتر من العازلة رد الفعل. وهذا سيؤدي إلى تخفيف 10 أضعاف من ATP مع تركيز النهائي من 2 mM.</li>
		<li>استخدم مخزون ATP 2 mM المتولد في الخطوة 1.4.2 لجعل التخفيف التالي في سلسلة التركيز. مزيج 1 μL من 2 mM ATP المخزون مع 9 ميكرولتر من التفاعل العازلة. وهذا سيجعل تركيز سهم ATP جديد من 0.2 mM.</li>
		<li>مواصلة التخفيف 1 μL من المخزون ATP السابقة مع 9 ميكرولتر من التفاعل العازلة لجعل الأسهم ATP اللاحقة في سلسلة التركيز.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. في المختبر RNA كيناز رد فعل
ملاحظة: يمكن استخدام هذا الفحص لقياس عدة متغيرات مثل الوقت، أو مستويات النيوكليوتيدات، أو تركيز الإنزيم. والهدف من هذه التجربة هو تقييم كمية الحمض النووي الريبي الفوسفوري في وجود ثابت Las1-Grc3 المعقدة ومستويات ATP متفاوتة.
<ol><li>لكل تفاعل كيناز RNA-انزيم، الجمع بين 1 ميكرولتر من 500 nM RNA الركيزة، 8.3 ميكرولتر من 130 nM Las1-Grc3، و 0.2 μL من 5 mM EDTA. ملاحظة: إذا كان تنفيذ العديد من ردود الفعل، وإعداد مخزون رئيسي من خليط RNA-انزيم و aliquot 9.5 μL من هذا المزيج الرئيسي لكل أنبوب رد فعل.</li>
	<li>إبدأ التشايس<ol>
<li>تعيين كتلة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.</li>
		<li>في فواصل 10 s، مزيج 0.5 ميكرولتر من واحد ATP substock من سلسلة تركيز ATP أعدت في الخطوة 1.4 مع واحد خليط انزيم RNA ووضع التفاعل في كتلة الحرارة 37 درجة مئوية. ملاحظة: إضافة 0.5 μL من العازلة رد فعل بدلا من ATP إلى واحد خليط RNA-انزيم لPNK التحكم السلبي. استخدام آخر السيطرة اللازمة كذلك (أي الركيزة RNA في غياب إنزيم PNK).</li>
		<li>احتضان ردود الفعل لمدة 60 دقيقة في 37 درجة مئوية. ملاحظة: الفلورسنتي المسمى RNA حساس للضوء; لذلك ، تغطية ردود الفعل مع احباط.</li>
		<li>باستخدام نفس الترتيب كما هو الحال في الخطوة 2.2.2، إخماد كل رد فعل كل 10 s عن طريق ارتفاع التفاعل مع 10 ميكرولتر من صبغة تحميل اليوريا (انظر الخطوة 1.1.2). ملاحظة: بالإضافة إلى 4 م يوريا، يمكن إضافة البروتين K في هذه الخطوة لتحلل إنزيم. اتبع التعليمات التي يقدمها المورد لتحديد كمية البروتياز المطلوبة وظروف التفاعل.</li>
		<li>استخدام ردود الفعل في المختبر في المختبر RNA كيناز فورا لتحليل المصب (انظر القسم 3) أو تخزين في -20 درجة مئوية لتحليلها في وقت لاحق.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. جل الكهرباء
<ol><li>إعداد 15٪ أكريلاميد/8 م محلول هلام اليوريا. تنبيه: يجب التعامل مع الأكريلاميد بعناية، لأنه سم عصبي. ارتدي دائماً القفازات ومعطف المختبر ونظارات واقية عند التعامل معها.<ol>
<li>في كوب زجاجي 150 مل، والجمع بين 22.5 مل من premixed 40٪ الأكريلاميد / bis-أكريلاميد 29:1 الحل، 6 مل من 10x TBE (انظر الخطوة 1.1.3)، 28.8 غرام من اليوريا، والمياه الخالية من RNase إلى حجم إجمالي قدره 59 مل. يحرك بلطف الحل. ملاحظة: اعتمادا على طول الركيزة RNA، تغيير النسبة المئوية من polyacrylamide قد يحسن القرار بين الحمض النووي الريبي غير مففوريريلات.</li>
		<li>لإذابة اليوريا، قم بسخّن المحلول في الميكروويف لمدة 20 s، حرك السائل، ثم وضع المحلول مرة أخرى في الميكروويف لمدة 20 s أخرى. يحرك بلطف الحل حتى يذوب اليوريا تماما.</li>
		<li>ببطء تبريد الحل عن طريق وضع كوب الزجاج في حمام المياه الضحلة التي تحتوي على الماء البارد. تأكد من أن مستوى الماء البارد المحيط بكأس كوب فوق مستوى المحلل داخل كوب الزجاج. وهذا من شأنه أن يعزز كفاءة نقل الحرارة. انتظر 5 دقائق. ملاحظة: لا تستمر مع هذا البروتوكول إذا كان كوب الزجاج يشعر دافئ; يجب أن يكون الماء أقل من 25 درجة مئوية. إذا كان لا يزال يشعر دافئ بعد 5 دقائق، ثم استبدال الماء في حمام الماء مع الماء البارد العذب وانتظر آخر 5 دقائق.</li>
		<li>تصفية وإزالة الحل باستخدام وحدة الترشيح 0.22 ميكرومتر المتاح لإزالة الجسيمات وفقاعات الهواء المجهرية.</li>
	</ol></li>
	<li>صب هلام denaturing.<ol>
<li>استخدم الصابون والماء الدافئ لتنظيف لوحة زجاجية قصيرة وطويلة مصممة للجلات ذات الأبعاد الإجمالية 31.0 سم × 38.5 سم. رش كل لوحة زجاجية مع الإيثانول 95٪ ومسح الزجاج لإزالة أي رطوبة. ملاحظة: يمكن أن تكون إحدى اللوحتين مُصفّتين لمنع تلف الجل عند فصل شطيرة الصفيحة الزجاجية. ومع ذلك، هذه الخطوة غير ضرورية لأن هذا البروتوكول تم تصميمه لتصور RNA دون فصل لوحات الزجاج.</li>
		<li>وضع لوحة زجاجية طويلة أفقيا على رأس مربع حتى يتم رفعها قبالة benchtop. تنبيه: الأكريلاميد سام، وبالتالي يجب تغطية محطة صب الجل في ورقة مقاعد البدلاء التي يمكن أن تمتص أي سائل منسكبة ويتم وضعها على الفور في كيس نفايات بعد اكتمال الإجراء.</li>
		<li>ضع 0.4 مم نظيفة على طول حواف طويلة من لوحة زجاجية طويلة.</li>
		<li>وضع لوحة زجاجية قصيرة فوق لوحة طويلة وضمان حواف لوحة قصيرة، لوحة طويلة، ويتم محاذاة الفواصل. المشبك كل جانب باستخدام ثلاثة المشابك المعدنية متباعدة بالتساوي.</li>
		<li>إضافة 24 μL من TEMED إلى 15٪ من محلول أكريلاميد/8 م يوريا المعدة في الخطوة 3.1 وخلط الحل.</li>
		<li>أضف 600 ميكرولتر من 10% (w/v) APS (انظر الخطوة 1.1.4) إلى الحل في الخطوة 3.2.5 ومزج الحل بلطف.</li>
		<li>صب على الفور الحل بين لوحات الزجاج. ملاحظة: لتجنب الفقاعات، انقر على الزجاج كما يتم صب الحل.</li>
		<li>إضافة بعناية نظيفة، 0.4 ملم، 32 مشط جيدا إلى الجزء العلوي من شطيرة لوحة زجاجية.</li>
		<li>السماح بحد أدنى من 30 دقيقة لالكريلاميد البلمرة.</li>
	</ol></li>
	<li>تشغيل هلام denaturing.<ol>
<li>تعيين كتلة الحرارة إلى 75 درجة مئوية.</li>
		<li>إزالة المشابك المعدنية عقد شطيرة لوحة الزجاج معا وغسل جيدا وتجفيف شطيرة لوحة الزجاج.</li>
		<li>ضع شطيرة لوحة الزجاج في جهاز الجل مع لوحة قصيرة تواجه الداخل.</li>
		<li>إعداد 0.5x TBE تشغيل العازلة من خلال الجمع بين 100 مل من TBE 10x مع 1.9 L RNase خالية من المياه. إضافة 600 مل من المخزن المؤقت تشغيل إلى الغرف العلوية والسفلى من جهاز هلام.</li>
		<li>قم بإزالة المشط بلطف وشطف الآبار بدقة باستخدام حقنة. ملاحظة: هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية لإزالة اليوريا من الآبار.</li>
		<li>تشغيل ما قبل هلام لمدة 30 دقيقة في 50 W. الجهد هو ما يقرب من 2000 V. تنبيه: يعمل هذا الجهاز الجل في قوة واط عالية والمستخدمين يجب أن تظهر الاحتياطات.</li>
		<li>شطف الآبار بدقة باستخدام حقنة. ملاحظة: هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية لتحميل حتى عينة في الآبار.</li>
		<li>نبض تدور ردود الفعل مطفأة من الخطوة 2.2.5. ثم احتضان الأنابيب في 75 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. كرر نبض تدور.</li>
		<li>على الفور تحميل 10 ميكرولتر من العينة في بئر وتشغيل هلام لمدة 3 ساعة في 50 W. ملاحظة: الفلورسنتي المسمى RNA حساس للضوء; لذلك، تغطية الجهاز هلام مع احباط.</li>
	</ol></li>
	<li>صورة هلام denaturing.<ol>
<li>إيقاف التيار الكهربائي واستنزاف الغرفة العليا للجهاز هلام.</li>
		<li>غسل وتجفيف الجانب الخارجي من شطيرة لوحة الزجاج باستخدام الصابون والماء. تغطية شطيرة لوحة الزجاج مع احباط أثناء نقل هلام.</li>
		<li>قم بتركيب شطيرة لوحة الزجاج على خشبة ماسح ليزر قادر على الكشف عن الفلورس الكمية والحساسة. ملاحظة: هذا الجل هو رقيقة للغاية لأقصى دقة. لهذا السبب، تم تصميم هذا البروتوكول لتجنب صعوبات إزالة الجل من شطيرة لوحة الزجاج عن طريق تصور مباشرة الحمض النووي الريبي الفلوري المسمى من خلال لوحات الزجاج. ومن ثم فإن استخدام الألواح الزجاجية المنخفضة الفلورية المتاحة تجارياً سيزيد الإشارة الملتقطة عن طريق تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء.</li>
		<li>تعيين الإثارة وأطوال موجية الانبعاثات من الماسح الضوئي بالليزر للفلوروفور المطلوب. ملاحظة: قد تختلف الإثارة المثلى وأطوال الانبعاثات الموجية بالنسبة للفلوروفوريس المحددة. وبالنسبة لفلوروفور FAM، تبلغ الأطوال الموجية للانبعاثات والإثارة 495 نانومتر و535 نانومتر على التوالي.</li>
		<li>تحديد المنطقة التي سيتم تصورها على مرحلة الماسح الضوئي بالليزر وصورة هلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (الشكل 1).</li>
	</ol></li>
</ol>4- تحليل الصور وتقدير كمية الإشارات
<ol><li>قم بتحميل صورة الجل الرقمي المكتسبة في الخطوة 3.4.5 في برنامج procesing للصور (انظر جدول المواد).</li>
	<li>باستخدام الزر الأيسر للماوس، انقر واسحب مستطيل لتحديد مربع قالب لوضع علامة على الحدود على الصورة هلام الرقمية التي سيتم استخدامها لتحديد كل نطاق RNA. الفرقة RNA ينظر في خليط التفاعل في مجموعة في غياب إنزيم PNK عادة ما تكون الفرقة جيدة لتوليد هذا القالب. ملاحظة: لتجنب التحيز الناتج عن إشارة الخلفية، من المهم أن تكون المنطقة المحيطة بكل نطاق RNA متطابقة. لهذا السبب، من الأفضل استخدام نفس مربع القالب لترسيم كل نطاق RNA.</li>
	<li>فتح مدير ROI تحت "أدوات" ووضع علامة على موقف مربع القالب بالنقر فوق "إضافة". ملاحظة: يمكن أيضاً رسم برامج الكمية مربعات تلقائياً بعد دليل مستخدم البرامج.</li>
	<li>باستخدام الزر الأيسر من الماوس، انقر واسحب مربع القالب إلى الفرقة RNA المقبلة وكرر الخطوة 4.3. Continute هذه العملية حتى تم وضع موقف جميع غير فوسفوريريلات رنا العصابات في كل رد فعل قد وضعت.</li>
	<li>قياس الكثافة المتكاملة داخل كل مربع عن طريق النقر فوق "قياس" في مدير ROI.</li>
	<li>لحساب الكمية النسبية من الحمض النووي الريبي الفوسفوري في رد فعل، تقسيم الكثافة المتكاملة من الفرقة الحمض النووي الريبي الفوسفوري على مجموع الكثافات المتكاملة من غير فوسفوري العصابات الحمض النووي الريبي والفوسفورية من نفس التفاعل. ويمكن أيضا أن يطبق هذا النهج لحساب المبلغ النسبي للرنا غيرphosphorylated.</li>
	<li>لتصور تراكم الرنا الفوسفوري المنتج واستنزاف المقابلة من الركيزة الحمض النووي الريبي غيرphosphorylated عبر سلسلة تركيز ATP، رسم المبلغ النسبي للرنا المحسوبة في الخطوة 4.6 ضد تركيز ATP.</li>
</ol>

<ol><li>Pillon, M. C., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclease+integrated+kinase+super+assemblies+%28NiKs%29+and+their+role+in+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing.</a> Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).</li>
<li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).</li>
<li>Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+Ribosomal+ITS2+RNA+Processing+by+the+Las1+Complex+Integrating+Endonuclease%2C+Polynucleotide+Kinase%2C+and+Exonuclease+Activities%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities.</a> Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).</li>
<li>Dikfidan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+specificity+and+regulation+of+catalysis+in+the+eukaryotic+polynucleotide+kinase+Clp1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1.</a> Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).</li>
<li>Bernstein, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+architecture+of+the+mammalian+DNA+repair+enzyme%2C+polynucleotide+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase.</a> Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).</li>
<li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27-end+labeling+of+RNA+with+%5Bgamma-32P%5DATP+and+T4+polynucleotide+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).</li>
<li>Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+labeling%2C+conjugation+and+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">RNA labeling, conjugation and ligation.</a> Methods. 54 (2), 251-259 (2011).</li>
<li>Hilario, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End+labeling+procedures%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">End labeling procedures: an overview.</a> Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).</li>
<li>Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+DNA+substrates+by+T4+bacteriophage+polynucleotide+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase.</a> Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).</li>
<li>Lillehaug, J. R., Kleppe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+specificity+of+T4+polynucleotide+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase.</a> Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).</li>
<li>Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+nucleic+acid+by+an+enzyme+from+T4+bacteriophage-infected+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).</li>
<li>Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+tRNA+repair+enzyme+and+molecular+biology+workhorse%3A+T4+polynucleotide+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase.</a> Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Molecular+Evolutionary+Analysis+Uncovers+a+Variety+of+Polynucleotide+Kinase+Clp1+Family+Proteins+in+the+Three+Domains+of+Life%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+Evolution%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life.</a> Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).</li>
<li>Jain, R., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+thermostable+archaeal+polynucleotide+kinase+homologous+to+human+Clp1%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1.</a> RNA. 15 (5), 923-931 (2009).</li>
<li>Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLP1+as+a+novel+player+in+linking+tRNA+splicing+to+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews+RNA%22%5BJournal%5D)">CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).</li>
<li>Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+T4+polynucleotide+kinase%3A+an+RNA+repair+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).</li>
<li>Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microchip+electrophoresis+laser+induced+fluorescence+detection+method+for+the+assay+of+T4+polynucleotide+kinase+activity+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors.</a> Talanta. 202, 317-322 (2019).</li>
<li>Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultrasensitive+electrochemical+biosensor+for+polynucleotide+kinase+assay+based+on+gold+nanoparticle-mediated+lambda+exonuclease+cleavage-induced+signal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).</li>
<li>Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Detection+of+Polynucleotide+Kinase+Based+on+Phosphorylation-Directed+Recovery+of+Fluorescence+Quenched+by+Au+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).</li>
<li>Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase%2Fphosphatase+activity+and+its+inhibitors+based+on+G-quadruplex%2Fhemin+DNAzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme.</a> Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).</li>
<li>Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+label-free+bioluminescent+sensor+for+real-time+monitoring+polynucleotide+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity.</a> Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).</li>
<li>Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase+activity+based+on+the+horseradish+peroxidase-mimicking+DNAzyme+combined+with+lambda+exonuclease+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage.</a> Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).</li>
<li>Castle, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Las1+interacts+with+Grc3+polynucleotide+kinase+and+is+required+for+ribosome+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).</li>
<li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3%2FLas1+pre-rRNA+processing+complex%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li>
<li>Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+final+step+in+the+formation+of+25S+rRNA+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+performed+by+5%27--%3E3%27+exonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'-->3' exonucleases.</a> RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).</li>
<li>Pillon, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+reveals+active+site+coordination+within+a+multienzyme+pre-rRNA+processing+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex.</a> Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).</li>
<li>Solomatin, S., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes.</a> Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).</li>
<li>Giusti, W. G., Adriano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+5%27-fluorescent-dye-labeled+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Application%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides.</a> PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).</li>
<li>Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+RNA+by+analytical+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).</li>
</ol>

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

وصف هو مقايسة لقياس نشاط كيناز من Grc3 PNK على ركائز النيوكليوتيدات الفلورية التي تحمل علامة. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول لتوصيف إنزيمات PNK الأخرى عن طريق تكييف العازلة رد الفعل وركيزة القلة. على سبيل المثال، يستدعي البروتوكول كمية من EDTA. إضافة EDTA مفيد لسببين: أولاً، هذا النهج يفضل Grc3 المرتبطة بالمغنيسيوم عن طريق منع الإنزيم من الربط إلى كميات ضئيلة من المعادن الملوثة في الخليط. ثانياً، هناك كمية صغيرة من EDTA تمنع نشاط تلويث الريبونوكleaس المعتمدة على المعادن دون تعطيل نشاط الريبونوكleaز المستقل للمعادن في Las1. و...

3- تلعب الكنايات المتعددة النوكليوتيدات (PNK) أدواراً حاسمة في العديد من مسارات معالجة الحمض النووي والحمض النووي الريبي ( DNA) ، مثل إصلاح الحمض النووي وتجميع الريبوسوم1،2،3،4،5. هذه الإنزيمات الأساسية تحفز نقل محطة (غاما) أحادي الفوسفات من ثلاثي الفوسفات النيوكليوسيد (NTP، في معظم الأحيان ATP) إلى نهاية الهيدروكسيل 5 'من الركيزة النيوكليوتيد. واحدة من أكثر PNKs تتميز بشكل جيد هو bacteriophage T4 PNK ، التي لديها خصوصية الركيزة العريضة وتستخدم بشكل كبير من قبل مختبرات البيولوجيا الجزيئية لدمج تسميات النظائر المشعة على 5 ذرة من الحمض النووي أو الركيزة RNA6،7،8،9،10،,12.11 مثال آخر من إنزيم PNK هو CLP1، الذي تم العثور عليه في Eukarya، Eubacteria، و Archaea، وتورط في عدة مسارات معالجة الحمض النووي الريبي4،13،14،15.
تاريخيا، معظم المقايسات التي تقيس نشاط كيناز متعدد النوكليوتيد تعتمد على وضع العلامات النظائر المشعة والتصوير الذاتي اللاحق5،16. في السنوات الأخيرة تم تطوير عدد من المقايسات إضافية لقياس نشاط PNK، بما في ذلك نهج جزيء واحد، electrophoresis رقاقة، منارات الجزيئية، وكذلك colorimetric والإنارة المستندة إلىالمقايسات 17،18،19،20،21،22. وفي حين أن العديد من هذه النهج الجديدة توفر حدوداً معززة للكشف وتتجنب استخدام النشاط الإشعاعي، فإن لكل منها عيوباً، مثل التكلفة والاعتماد على الراتنج غير المُجَدَّد، والقيود المفروضة على اختيار الركيزة.
Grc3 هو كيناز متعدد النوى التي تلعب دورا محوريا في معالجة ما قبل الريبوزوم RNA2,3,23. Grc3 يشكل مجمع ملزم مع endoribonuclease Las1، الذي يشقوق الداخلية المناسخة 2 (ITS2) من الجيش الملكي النيبالي قبل الريبوسوم3. انشقاق ITS2 بواسطة Las1 يولد منتج إيواء 5 'الهيدروكسيل التي هي في وقت لاحق phosphorylated من قبل kinase Grc33. للتحقيق في النيوكليوتيد وخصوصية الركيزة من Grc3، كان مطلوبا اختبار غير مكلفة التي سمحت باختبار ركائز oligonucleotide مختلفة. ولذلك، تم تطوير مقايسة فوسفيجيلة PNK باستخدام ركائز مسمّاة بالفلورسنت. تم استخدام هذا الفحص بنجاح لتحديد أن Grc3 يمكن الاستفادة من أي NTP لنشاط نقل الفوسفوريل، ولكن تفضل ATP24. هذا البروتوكول يكيف المقايسة الأصلية لقياس نشاط PNK من Grc3 على تقليد الحمض النووي الريبي لركيزة الحمض النووي الريبي (SC-ITS2، الجدول 1). أحد الجوانب الصعبة لهذا النهج القائم على الفلورسين هو الاعتماد على جلات البولي أكريلاميد الكبيرة لحل ركائز الفوسفور وغير الفوسفورية بشكل فعال. ويوفر البروتوكول تفاصيل محددة حول كيفية صب هذه المواد الهلامية الكبيرة وتجنب المزالق الشائعة عند القيام بذلك.
يتطلب العمل مع الحمض النووي الريبي عناية خاصة لأنه معرض بشدة للتدهور. هناك خطوات وقائية بسيطة يمكن للمرء أن تتخذ للحد من التلوث ريبونوكليس. محطة عمل منفصلة الحمض النووي الريبي التي يمكن علاجها بسهولة مع عامل التنظيف RNase التي تحتوي على مثبطات غالبا ما تكون مفيدة. من الضروري ارتداء القفازات دائمًا عند التعامل مع العينات واستخدام المواد الاستهلاكية المعتمدة الخالية من RNase. لأن المياه هي مصدر آخر للتلوث، فمن الأفضل استخدام المياه النقية الطازجة وتعقيم جميع الحلول باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.

<table><tbody><tr><td>0.4 مم مشط 34 بئر</td><td>BioRad</td><td>1653848</td><td></td></tr><tr><td>فاصل 0.4 مم</td><td>BioRad</td><td>1653812</td><td></td></tr><tr><td>0.5 م EDTA ph 8.0</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3130</td><td></td></tr><tr><td>1M كلوريد المغنيسيوم</td><td>KD Medical</td><td>CAC-5290</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris pH 8.0</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3360</td><td></td></tr><tr><td>40٪ محلول أكريلاميد / مكرر 29: 1</td><td>BioRad</td><td>1610146</td><td></td></tr><tr><td>5M كلوريد الصوديوم</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3720</td><td></td></tr><tr><td>بيرسلفات الأمونيوم (APS)</td> <td>BioRad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A2383-1G</td><td></td></tr><tr><td>حمض البوريك</td><td>Sigma</td><td>B0394</td><td></td></tr><tr><td>بروموفينول ملح الصوديوم الأزرق</td><td>Sigma</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>ألواح زجاجية</td><td>توماس Scientific</td><td>1188K51</td><td></td></tr><tr><td>Hoefer SQ3 Sequencer</td><td>Hoefer</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>صورة J Software</td><td>N / A</td><td>N / A</td> <td><A HREF = "https://imagej.nih.gov/ij/" TARGET = "_blank" >https://imagej.nih.gov/ij/< / A ></td></tr> <tr><td>المسمى RNA OLIGONUCLEOTIDES</td><td>IDT</td><td>طلب</td><td></td>مخصص</tr><tr><td>Pharmacia EPS 3500 امدادات الطاقة</td><td>Pharmacia</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip 0. 22 ميكرومتر فلتر</td><td>ميليبور</td><td>5FCP00525</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BioRad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>تريس بيس</td><td>سيجما</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><tr><td>تايفون FLA 9500 جل تصوير</td><td>GE Healthcare</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Pure DEPC Water</td><td>Invitrogen</td><td>750023</td><td></td></tr><tr><td>فائق النقاء الجلسرين</td><td>Invitrogen</td><td>19E1056865</td><td></td></tr><tr><td>اليوريا</td><td>فيشر كيماويات</td><td>U15-500</td><td></td></tr></tbody></table>

مُقَسَم غير كهربي لقياس فوسفورية البولي نووكليوتيد من ركائز النيوكليوتيدات الصغيرة

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

الكنايات المتعددة النوكليوتيدات (PNKs) هي إنزيمات تحفز الفسفر من نهاية الهيدروكسيل 5 'من الحمض النووي والحمض النووي الريبي oligonucleotides. ويمكن قياس نشاط الـ PNK باستخدام نهج مباشرة أو غير مباشرة. يُعرض هنا نهج مباشر في المختبر لقياس نشاط PNK الذي يعتمد على الركيزة القلوية ذات التسمية الفلورية وأوليغونوكليوتيد وبوليكريلاميد هلام الكهرباء. يوفر هذا النهج القرار من المنتجات الفوسفورية مع تجنب استخدام ركائز radiolabeled. البروتوكول تفاصيل كيفية إعداد تفاعل الفوسفور، وإعداد وتشغيل المواد الهلامية بوليكلايد كبيرة، وقياس منتجات التفاعل. الجزء الأكثر تحديا من الناحية الفنية من هذا المقايسة هو صب وتشغيل المواد الهلامية بوليكريلايد كبيرة; وبالتالي، يتم توفير تفاصيل هامة للتغلب على الصعوبات المشتركة. تم تحسين هذا البروتوكول لGrc3، وهو PNK الذي يتجمع في مجمع معالجة الحمض النووي الريبي الإلزامي مع شريكه الملزم، النوى Las1. ومع ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لقياس نشاط الإنزيمات PNK الأخرى. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن يتم تعديل هذا الفحص لتحديد آثار مختلف مكونات التفاعل، مثل ثلاثي الفوسفات النووي، والأيونات المعدنية، وأوليغونوكليوتيدات.

يظهر في الشكل 1هلام denaturing ممثل ناجح من المعايرة من ATP مع كمية ثابتة من مجمع Las1-Grc3 . إضافة انزيم أدى إلى انشقاق RNA بوساطة لاس1 من الركيزة الحمض النووي الريبي SC-ITS2، مما أدى إلى جزء RNA محدد (5-OH C2 RNA). عند إضافة ATP، تم فسفور شظايا الحمض النووي الريبي C2 بواسطة Grc3 PNK (5-P C2 RNA). في الهلام الهلامي النافورج ينجر الرنا أسرع من نظيره غيرphosphorylated. كما هو مبين في الشكل 2، يمكن تصور الفوسفور من ج2 RNA جزء من رس...

يصف هذا البروتوكول مقايسة غير نشطة لقياس نشاط كيناز من كينازات البولي نوكليوتيد (PNKs) على ركائز الحمض النووي والحمض النووي الريبي الصغيرة.

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول الفوسفور من نهاية خمسة رئيس من جزيئات الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي من قبل فئة خاصة من الإنزيمات المعروفة باسم كيناز متعدد النوى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أن لديه القرار للكشف عن تغييرات صغيرة جدا في الحمض النووي وركائز الحمض النووي الريبي. تبدأ من خلال إعداد ردود الفعل كيناز انزيم الحمض النووي الريبي.لكل رد فعل، والجمع بين ميكرولتر واحد من 500 الركيزة الحمض النووي الريبي نانومولار. 8.3 ميكرولترات من 130 نانوموللار آخر واحد، GRC ثلاثة و 0.2 ميكرولترات من خمسة ملليمولار EDTA. تعيين كتلة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.ثم مزيج 0.5 ميكرولترات من مخزون ATP الفرعية من سلسلة تركيز مع خليط انزيم RNA واحد ووضع التفاعل على كتلة الحرارة. مواصلة خلط ردود الفعل ووضعها على كتلة الحرارة في عشر فترات ثانية. بعد 60 دقيقة حضانة على كتلة الحرارة، وتروي كل رد فعل عن طريق رفع عليه مع 10 ميكرولترات من صبغة تحميل اليوريا.قم بإجراء تحليل المصب على الفور أو تخزين ردود الفعل عند درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية ليتم تحليلها في وقت لاحق. لإعداد 15٪ denaturing محلول هلام الأكريلاميد، والجمع بين 22.5 ملليلتر من ما قبل مختلطة 40٪ 29 إلى حل واحد أكريلاميد / مكرر الأكريلاميد. ستة ملليلترات من عشرة x TBE.28.8 غرام من اليوريا. و RNase المياه مجانا إلى حجم إجمالي قدره 59 ملليلتر. ثم يحرك بلطف الحل.سخني المحلّل في الميكروويف لمدة 20 ثانية. اثارة عليه وإعادته على الفور إلى الميكروويف لمدة 20 ثانية أخرى. يحرك بلطف الحل حتى يتم حل اليوريا تماما.ضع كوب الزجاج في حمام ماء ضحل ، يحتوي على الماء البارد لمدة خمس دقائق ، مع التأكد من أن مستوى الماء البارد المحيط بقارب الزجاج أعلى من مستوى الحل داخل كوب الزجاج. عندما يكون الحل بارد، تصفية وإزالة الغاز مع 0.2 اثنين من وحدة الترشيح ميكرومتر المتاح لإزالة الجسيمات وفقاعات الهواء المجهرية. اغسلي لوحة زجاجية قصيرة وطويلة بالصابون والماء ثم رش كل طبق بنسبة 95٪ الإيثانول وامسحي الزجاج لإزالة أي رطوبة.رفع لوحة طويلة قبالة أعلى مقاعد البدلاء عن طريق وضعه على رأس مربع. ثم ضع 0.4 ملليمتر الفواصل على طول حواف طويلة من لوحة. وضع لوحة قصيرة على رأس لوحة طويلة، والتأكد من أن حواف لوحة قصيرة، لوحة طويلة والفواصل هي الانحياز.ثم المشبك كل جانب مع ثلاثة المشابك المعدنية متباعدة بالتساوي. أضف 24 ميكرولترات من TEMED إلى محلول الأكريلاميد واخلطه. ثم إضافة 600 ميكرولترات من 10٪ APS وعلى الفور صب الحل بين لوحات الزجاج.صب حل الاكريلاميد بين شطيرة لوحة الزجاج يمكن أن يكون تحديا حقا. لتجنب فقاعات الهواء، اضغط على شطيرة لوحة الزجاج أثناء صب الحل الخاص بك. إضافة بعناية نظيفة 32-جيدا مشط إلى الجزء العلوي من شطيرة لوحة زجاجية.واسمحوا الأكريلاميد البلمرة لمدة 30 دقيقة. لتشغيل الجل، تعيين كتلة الحرارة إلى 75 درجة مئوية. إزالة المشابك المعدنية.وغسل جيدا وتجفيف شطيرة لوحة الزجاج. وضع شطيرة لوحة وجهاز هلام مع لوحة قصيرة تواجه إلى الأمام وإعداد 0.5 X TBE تشغيل العازلة من خلال الجمع بين 100 ملليلتر من 10 X TBE مع 1.9 لتر من المياه الحرة RNase. إضافة 600 ملليلتر من المخزن المؤقت تشغيل إلى الغرف العليا والسفلى من الجهاز.قم بإزالة المشط بلطف من الجل وشطف الآبار جيدًا باستخدام حقنة. تشغيل ما قبل هلام في 50 واط لمدة 30 دقيقة. ثم شطف الآبار مرة أخرى.آخر تدور ردود الفعل إخماد واحتضان لهم في 75 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. كرر نبض تدور وتحميل على الفور 10 ميكرولترات من كل عينة على هلام. ثم تشغيل هلام لمدة ثلاث ساعات في 50 واط.عندما انتهت المدى، إيقاف التيار الكهربائي واستنزاف الغرفة العليا للجهاز. غسل وتجفيف الجانب الخارجي من شطيرة لوحة الزجاج. ثم غطيها بورق ونقلها إلى ماسح ليزر للتصوير.جبل شطيرة لوحة الزجاج على خشبة المسرح من الماسح الضوئي بالليزر. تعيين الإثارة وأطوال موجية الانبعاثات للأرضية المطلوبة لصورة هلام. يظهر هنا هو ممثل هلام denaturing ناجحة من المعايرة ATP مع كمية ثابتة من آخر GRC ثلاثة مجمع.إضافة الإنزيم أدى إلى آخر واحد توسطت الجيش الملكي النيبالي انشقاق من Saccharomyces cerevisiae ITS اثنين من الركيزة RNA، مما أدى إلى جزء RNA محددة. عند إضافة ATP، تم فسفور شظايا الحمض النووي الريبي C2 بواسطة GrC3 PNK. لتصور الفسففور من شظايا الحمض النووي الريبي C2، تم رسم الكمية النسبية من الحمض النووي الريبي C2 غيرphosphorylated وفسفورية ضد تركيز ATP.ممثلنا غير ناجحة هلام denaturing يظهر هنا. وتحتوي الركيزة الـ 21 من النيوكليوتيدات RNA على منتجات تحلل، تتداخل مع المنتج الفوسفوري وجعلت من المستحيل تحديد الفوسفور بدقة. وعلى النقيض من ذلك، يمكن تحليل أدنى ناتج لتحلل الحمض النووي الريبي بنجاح لأن هذه المنطقة من الجل لم تتضمن أي أنواع إضافية من الحمض النووي الريبي تعوق التحديد الكمي الدقيق لنظيرها الفوسفوري.أهم شيء أن نتذكر عند محاولة هذا البروتوكول هو شطف آبار هلام لضمان تحميل حتى من العينة الخاصة بك. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء تجربة دوران RNA. لقياس معدلات تحلل الحمض النووي الريبي، غالباً ما يشير التفسيّر إلى بدء تحلل الحمض النووي الريبي.هذه التقنية تمهد الطريق للإجابة على الأسئلة التفصيلية حول خصوصية الأنشطة والحركات من الكنايات المتعددة النوى.

nonradioactive-assay-to-measure-polynucleotide-phosphorylation-small

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

في هذا الفيديو ، نوضح الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد متغير الطبيعة لفصل أنواع الحمض النووي الريبي الفسفوري عن نظيراتها غير الفسفرية. يتم تصنيف أنواع الحمض النووي الريبي بالفلورسنت للكشف بالليزر على الجل.

تغيير طبيعة الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد اليوريا لتحليل الحمض النووي الريبي: تقنية لفصل قليل النوكليوتيدات الحمض النووي الريبي الفسفرية المسمى بالفلورسنت عن نظيراتها غير الفسفرية

يوضح هذا الفيديو تقنية قياس كمية حساسة لفسفرة البروتين باستخدام مقايسة منسدلة أحادية الجزيء. يزيد تشغيل البولي إيثيلين جلايكول البيوتين واستخدام الأجسام المضادة المصنفة من اكتشاف التيروزين الفسفوري بخصوصية.

مقايسة سحب الجزيء الواحد لتحليل فسفرة البروتين: تقنية إنتاجية عالية لتحديد فسفرة البروتين في محللة الخلية

يسين الغنية تكرار تحركات 1 و 2 (LRRK1 وLRRK2) هي بروتينات متعددة المجالات التي ترميز كل من GTPase والمجالات كيناز والتي هي فسفرته في الخلايا. هنا، نقدم بروتوكول لتسمية LRRK1 وLRRK2 في الخلايا مع 32 P الفوسفاتية، وبالتالي توفير وسيلة لقياس مستويات الشاملة phophorylation الخلوية.

الأيضية وصفها من لوسين ريتش كرر تحركات 1 و 2 مع المشعة الفوسفات

يمثل البروتوكول الموصوف هنا طريقة سهلة وقابلة للتكرار تستخدم الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء ذات الطور العكسي (RP-HPLC) لقياس استقلاب البيورين على خلايا ابيضاض الدم الليمفاوي المزمن (CLL) المزروعة في ظل ظروف مختلفة.

القائم HPLC الفحص لمراقبة خارج الخلية النكليوتيد / نوكليوزيد الأيض في خلايا سرطان الدم الليمفاوي المزمن الإنسان

نقوم بالإبلاغ عن اختبار ربط النيتروسليلوز المحسن الذي يمكن استخدامه لتحديد كمية الفسفرة الذاتية لكينازات الهيستيدين البكتيرية المنقاة. تتميز طريقتنا بالعديد من المزايا مقارنة بالتقنيات التقليدية القائمة على SDS-PAGE ، مما يوفر بديلا قيما لتوصيف هذه البروتينات المهمة.

الكمي للبكتيريا الحامض الأميني كيناز Autophosphorylation باستخدام الفحص النيتروسليلوز التجليد

تتطور الكينازات البروتينية بشكل كبير الإنزيمات والسقالات التي هي حاسمة لانتشار إشارة بين الخلايا وداخل الخلايا. نقدم بروتوكول لقياس نشاط كيناز من خلال استخدام أدينوسين ثلاثي الفوسفات راديولبلد ([γ- 32 P] أتب)، وهي طريقة موثوق بها للمساعدة في توضيح تنظيم الإشارات الخلوية.

فحص البروتين كيناس النشاط مع راديولابيلد أتب

وتستخدم المقايسات المنافسة الببتيد على نطاق واسع في مجموعة متنوعة من التجارب الجزيئية والمناعية. هذه الورقة تصف طريقة مفصلة لفي المختبر أوليغوببتيد-تنافس فحص كيناز وإجراءات المصادقة المرتبطة بها، والتي قد تكون مفيدة للعثور على مواقع الفسفرة محددة.

أوليغوببتيد مسابقة الفحص لتحديد موقع الفسفرة

يصف لنا طريقة بسيطة للقياس الكمي السريع من وميلامين متعدد الفوسفات غير العضوية في البكتيريا المتنوعة، بما في ذلك الأنواع المتفطرات إيجابية وسلبية الغرام.

المعايرة وميلامين متعدد الفوسفات غير العضوية في البكتيريا

وقد تم تكييف فحص أدينوكليوتيد أدينين (NADH) المقترنة ATPase لفحص الإنتاجية شبه العالية من مثبطات الموسين جزيء صغير. يتم تشغيل هذا التقييم الحركي في شكل لوحة دقيقة 384 جيدا مع أحجام التفاعل الكلي من 20 ميكرولتر فقط لكل بئر. يجب أن تكون المنصة قابلة للتطبيق على أي إنزيم منتج من ADP تقريبًا.

تكييف شبه عالي الإنتاجية لفحص ATPase المقترن بـ NADH لفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لفحص إنزيمات استقلاب الحمض النووي ، باستخدام أمثلة على إنزيمات ligase و nuclease و polymerase. يستخدم الفحص قليل النيوكليوتيدات الموسومة بالفلورسنت وغير المسماة والتي يمكن دمجها لتشكيل دوبلكس تحاكي أضرار الحمض النووي الريبي و / أو الحمض النووي أو وسيطة المسار ، مما يسمح بتوصيف سلوك الإنزيم.

استخدام قليل النيوكليوتيدات الاصطناعية المعدلة لفحص إنزيمات استقلاب الحمض النووي

تعلم قياس نشاط كيناز البولي نووكليوتيدات على ركائز DNA وRNA الصغيرة بطريقة غير كهربية. تكشف هذه التقنية عن تغيرات صغيرة في الفوسفوريلة عند الطرف 5' للأحماض النووية.

مُقَسَم غير كهربي لقياس فوسفورية البولي نووكليوتيد من ركائز النيوكليوتيدات الصغيرة

استكشف المزيد من الفيديوهات