Name: إلى الأمام الشاشة الجينية باستخدام المعدلة وراثيا مراسل الكالسيوم أيكورين لتحديد أهداف جديدة في إشارات الكالسيوم (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: اكتشف طريقة الفحص الجيني الأمامي لتحديد الجينات المشاركة في إشارات الكالسيوم في نبات Arabidopsis باستخدام تقنية التطفير العشوائي EMS والمستحضر الحيوي أيكورين.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر المعهد الوطني لبحوث الجينوم النباتي - مرفق Phytotron لنمو النبات ، وبومباي المحلية لتصوير الفيديو ، وإدارة التكنولوجيا الحيوية - eLibrary كونسورتيوم لتوفير الوصول إلى الموارد الإلكترونية. وقد دعم هذا العمل من قبل وزارة التكنولوجيا الحيوية، الهند من خلال المعهد الوطني لبحوث الجينوم النباتي منحة الأساسية، ماكس بلانك Gesellschaft الهند شريك برنامج المجموعة; و CSIR-جونيور زمالة البحث (لD.M و S.M) وقسم التكنولوجيا الحيوية - زمالة البحوث المبتدئين (إلى R.P).

1- تَمَتَّسُ تكوين نظم الإدارة البيئية وجمع البذور الأحادية النسب (1-3 أشهر)
<ol><li>تزن 150 ملغ من البذور (~ 7500) من أيكورين لEMS mutagenesis (م0 البذور). تزن آخر 150 ملغ من البذور لاستخدامها كتحكم.</li>
	<li>نقل البذور إلى أنبوب 50 مل وإضافة 25 مل من 0.2٪ EMS (الخامس / الخامس) (تنبيه) (للعلاج) أو 25 مل من الماء autoclaved (للسيطرة). ملاحظة: سلفونات الإيثيل - الميثان هي عامل كيميائي في عملية التكاء في المواد النباتية.</li>
	<li>ختم الأنبوب مع parafilm والتفاف عليه في رقائق الألومنيوم. قم بتدوير الأنبوب من النهاية إلى النهاية لمدة 18 ساعة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>السماح للبذور لتسوية. إزالة حل EMS بعناية والتخلص في حاوية النفايات التي تحتوي على 1 M NaOH في وحدات تخزين متساوية (NaOH يساعد على تحييد / تعطيل EMS مما يجعلها آمنة للتخلص). تجاهل البلاستيك المستخدمة في محلول 1 M NaOH. ملاحظة: بعد 24 ساعة، تخلص من المرتجعات وفقاً لممارسات مختبر المواد الخطرة.</li>
	<li>اغسل البذور المُمَتَمَّعة تمامًا مع 40 مل من الماء المُقلَد ذاتيًا 8 مرات على الأقل. تخلص EMS تحتوي على المياه في حاوية نفايات NAOH كما ذكر أعلاه.</li>
	<li>لغسل النهائي، إضافة 40 مل من 100 mM ثيوسلفات الصوديوم وشطف 3 مرات لإزالة آثار EMS.</li>
	<li>نقع البذور في 40 مل من الماء autoclaved ل ~ 1 ح لنشر EMS من البذور ومن ثم وضعها على ورقة مرشح حتى يجف تماما.</li>
	<li>نقل البذور إلى أنبوب microcentrifuge وطبقة البذور في 4 درجة مئوية في 40 مل من المياه autoclaved لمدة 2-4 أيام. وهذا يساعد في كسر النوم البذور ويضمن النمو متجانسة.</li>
	<li>نقل كل من البذور المطفرة (M0)والبذور التحكم على التربة (تكوين التربة: الزراعية: تربة، 1:1) ونقلها إلى غرف النمو مع 16 ساعة ضوء/ 8 ساعة ضوئية داكنة، وكثافة خفيفة من 150 ميكرومول •m−2•s −1 و ~ 70٪ الرطوبة النسبية.</li>
	<li>لتحديد ما إذا كان الطفرات قد نجحت، ابحث عن انخفاض سرعة الإنبات ونمو الشتلات، وقطاع الكلوروفير18 (الشكل 1A). قارن النباتات المطفرة مع النباتات التحكم لتحديد هذه الاختلافات الفسيولوجية والتنموية. ملاحظة: يمكن استخدام طرق مختلفة لحصاد البذور من النباتات M1. في هذا البروتوكول، استخدمنا أسلوب تجميع البذور أحادي النسب المستندة. كل مصنع M1 يعطى رقما فريدا، بدءا من A1 إلى A3500.</li>
	<li>الحفاظ على النباتات المرقمة بشكل فردي كلخطوط نباتية منفصلة (الشكل 1B).</li>
	<li>عند النضج، حصاد البذور من هذه النباتات متحولة الفردية وتخزينها على النحو الفردية خطوط M1 (الشكل 2). من مجموعة البذور على أساس نسب واحد، حصلنا على حوالي 5000 M1 خطوط من الذي تم فحص 3500 M1 خطوط.</li>
</ol>2. فحص عالي الإنتاجية لتحديد المسوخ (8 أشهر)
<ol><li>تحديد المسوخ الجديدة على أساس استجابة Ca2+ إلى حافز مختار. هنا، استخدمنا H2O2 كمثال.</li>
	<li>لتحديد المسوخ، قم بفحص الجيل M2. منذ المسوخ المتنحية فصل في 1/8 تردد في M2 جيل على EMS mutagenesis14، فحص 8-12 M2- تغطي النباتات الفصل واحد M1 خط ويحدد متحولة متجانسة homozygous (باستخدام 12 شتلة يزيد من احتمال العثور على متحولة). من كل خط M1 مستقل، اختبار 12 M2 الشتلات لCa2+ استجابة لH2O2 (12 M2 الشتلات لكل خط M1).</li>
	<li>استخدام عالية الإنتاجية التعقيم البذور والزراعة المائية بروتوكول نمو النباتات19. ضع ما يقرب من 12-15 M2 البذور لكل M1 خط في الآبار الفردية من 24 بئرا النسيج لوحة الثقافة وتعقيم باستخدام غاز الكلور (40 مل من 12٪ هيبوكلوريت الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك، 3:1، v / الخامس) في desiccator لمدة 4 ساعة في غطاء الدخان. بعد الإجراء، افتحي جهاز الـ 1000 واتركيه بين عشية وضحاها ليتبخر غاز الكلور.</li>
	<li>بعد التعقيم، وجلب لوحات خارج وإضافة السائل 1/2 وسائل الإعلام MS (MS نصف قوة دون أجار) إلى الآبار الفردية. ختم لوحات مع parafilm وطبقات البذور لمدة 2-4 أيام في 4 °C ثم نقل البذور إلى غرفة النمو مع 10 ساعة خفيفة / 14 ساعة photoperiod الظلام في 20-22 درجة مئوية مع 70٪ الرطوبة النسبية.</li>
	<li>مرة واحدة الشتلات هي 8-12 يوما من العمر، مكان 12 M2 الشتلات من كل خط على حدة في لوحة مضيئة 96-جيدا. لقياس استجابة Ca2+ إلى H2O2، استخدم قارئ لوحة مضيئة.</li>
	<li>بعد نقل الشتلات، إضافة 150 ميكرولتر من 5-10 ميكرومتر محلول coelentrazine (المخفف في الماء المذاب من مخزون 5 mM في الميثانول) (تنبيه) في الآبار الفردية في منطقة مظلمة / منخفضة الإضاءة وتخزينها في الظلام في 21 درجة مئوية لمدة 8 ساعات. ملاحظة: Coelentrazine هي مجموعة اصطناعية تربط بـ apo-aequorin وتُعيد تشكيلها إلى الأيكورين الوظيفي. Coelentrazine هو ضوء حساس ومن ثم يتم تخزينها في زجاجات داكنة اللون، محمية من الضوء.</li>
	<li>في اليوم التالي، قم بأداء شاشة متحولة باستخدام 10 mM H2O2 كحافز وقياس استجابة Ca2+ اللاحقة.</li>
	<li>وللت وقياس 24 بئرًا في وقت واحد، أنشئ برنامجًا حركيًا آليًا يقيس الخلفية لمدة دقيقة، يليه إضافة منبهات (40 ميكرولتر) وقياس 10 دقائق، يليه إجمالي تصريف الـequorin (2 M CaCl2 في 150 ميكرولتر 20٪ إيثانول) لمدة 1-2 دقيقة. ملاحظة: هناك حاجة إلى التفريغ النهائي للـ aequorin الكلي لتحديد كمية درجة Ca2+ المقاسة والتحكم الإضافي للـ aequorin الوظيفية. التفريغ نهاية قصيرة من 1-2 دقيقة ولا يسبب وفاة النبات كبيرة. بدلا من ذلك، إذا كانت النباتات تموت بعد خطوة التفريغ، ثم إعادة فرز خط M1 محددة والإنقاذ دون تفريغ. ويمكن تأكيد هذه المسوخ في M3 و M4 الأجيال باستخدام خطوة التفريغ.</li>
	<li>استخدم طريقة مسح بتنسيق 24 بئرًا تقيس كل صف في فاصل زمني 7 s مع وقت تكامل 300 مللي ثانية لكل نقطة قياس. استخدام شتلة من نوع البرية كتحكم في كل صف للمقارنة والتقييم من متحولة. ملاحظة: ستغطي 96 بئرًا واحدة تحتوي على شتلات M2 8 خط M1 فردي (8 M1*12 = 96 M2)ويمكن فحصها في 2.5 ساعة وسيتم فحص 32 M1 خطوط في اليوم ، 640 M1 محطات في الشهر. يستغرق إجراء الفحص بالكامل بعد أن تصبح النباتات جاهزة حوالي 8 أشهر.</li>
	<li>تحديد المسوخ على أساس فقدان أو انخفاض استجابة كاليفورنيا2+ مع H2O2. إنقاذ المسوخ المختارة من خلال عملية غسل تعتمد على المضادات الحيوية. غسل الشتلات مع 25 ملغ / L محلول cefotaxime مرتين ثم نقل إلى وسط الإنقاذ الذي يحتوي على 25 ملغ / لتر cefotaxime في 1/2 MS agar.</li>
	<li>تنمو لوحات في ضوء 10 ساعة / 14 ساعة photoperiod الظلام للحصول على نبات متحولة. غسل cefotaxime يساعد على إزالة أي الكائنات الحية الدقيقة الضارة على الشتلات. منذ يتم الاحتفاظ بالشتلات بعد إعادة تشكيل غير مختومة، والحد من التلوث عند نقل مرة أخرى إلى حالة معقمة.</li>
	<li>نقل النبات متحولة إلى التربة للحصول على homozygous M3 السكان.</li>
</ol>3 - تحليل البيانات وتحديد الهوية المتحولة (شهر إلى ثلاثة أشهر)
ملاحظة: القراءات المقدمة من الأسلوب أعلاه في وحدات الضوء النسبي (RLU).
<ol><li>لحساب [Ca2+] تركيزالسيّدات، استخدم معادلة التركيز التالية20. pCa = 0.332588(−log (L/Lكحد أقصى))+ 5.5593 التلألؤ التهم () ومجموع عدد المتبقية (كحد أقصى).</li>
	<li>قم بتحويل قيم pCa التي تم الحصول عليها إلى [Ca2+]قيمcyt في μM عن طريق الضرب في 106. ثم مؤامرة بيانيا ضد aequorin (المعدلة وراثيا كول-0 aequorin) السيطرة على تحديد المفترض H2س2 المسوخ إلى Ca2 + الاستجابة.</li>
	<li>شتلات الإنقاذ التي تظهر فقدان أو انخفاض الاستجابة إلى H2O2 تم إنقاذها.</li>
	<li>عند النضج، حصاد البذور من متحولة إنقاذها وإعادة فرز للاستجابة لH2O2 في الشتلات M3. إذا كانت جميع الشتلات 12 M3 تظهر استجابة كاليفورنيا2 + مماثلة للنبات الأم، والنظر في السكان أن تكون متجانسة M3 السكان متحولة. إذا لم تظهر جميع الشتلات 12 مثل هذا الرد، ثم تأخذهم إلى الجيل M4 وإعادة الشاشة للحصول على السكان homozygous.</li>
	<li>بمجرد الحصول على خط نبات متماثل ، حدد الجين الذي يؤدي إلى النمط الظاهري المتغير باستخدام تسلسل الجيل التالي.</li>
</ol>

<ol><li>Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signals%3A+The+lead+currency+of+plant+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signals: The lead currency of plant information processing.</a> The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).</li>
<li>Wasternack, C., Hause, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jasmonates%3A+biosynthesis%2C+perception%2C+signal+transduction+and+action+in+plant+stress+response%2C+growth+and+development.+An+update+to+the+2007+review+in+Annals+of+Botany%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany.</a> Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).</li>
<li>Kiep, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+cytosolic+Ca2%2B+elevation+is+activated+upon+wounding+and+herbivory+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis.</a> New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin-based+Luminescence+imaging+reveals+stimulus-+and+tissue-specific+Ca2%2B+dynamics+in+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants.</a> Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).</li>
<li>White, P. J., Broadley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Calcium in plants.</a> Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).</li>
<li>Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mutant+impaired+in+intracellular+calcium+elevation+is+sensitive+to+biotic+and+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 162(2014).</li>
<li>Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The language of calcium signaling.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).</li>
<li>Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+calcium+signalling+and+early+signalling+elements+during+defence+responses+to+microbe-+or+damage-associated+molecular+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns.</a> The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).</li>
<li>Downie, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signals+in+plant+immunity%3A+a+spiky+issue%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Calcium signals in plant immunity: a spiky issue.</a> New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).</li>
<li>Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutual+interplay+of+Ca2%2B+and+ROS+signaling+in+plant+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response.</a> Plant Science. 283, 343-354 (2019).</li>
<li>McAnish, M. R., Pittman, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+calcium+signature%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Shaping the calcium signature.</a> New Phytologist. 181, 275-294 (2009).</li>
<li>Colbert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+-throughput+screening+for+induced+point+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">High -throughput screening for induced point mutations.</a> Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).</li>
<li>Koornneef, M. Classical mutagenesis in higher plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoornneef%2C+M+%22Molecular+Plant+Biology%22">Molecular Plant Biology</a>. Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. , Oxford University Press. 1-10 (2002).</li>
<li>Page, D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).</li>
<li>Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+plant+aequorin+reports+the+effects+of+touch+and+cold-shock+and+elicitors+on+cytoplasmic+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium.</a> Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).</li>
<li>Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanaka%2C+K+%22G+Protein-Coupled+Receptor+Signaling+in+Plants.+Methods+in+Molecular+Biology+%28Methods+and+Protocols%29%22">G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols)</a>. Running, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 45-54 (2013).</li>
<li>Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+aequorin+monitors+cytosolic+calcium+transients+in+soybean+cells+challenged+with+beta-glucan+or+chitin+elicitors%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors.</a> Planta. 207 (4), 566-574 (1999).</li>
<li>Arisha, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethyl+methane+sulfonate+induced+mutations+in+M2+generation+and+physiological+variations+in+M1+generation+of+peppers+%28Capsicum+annuum+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.).</a> Frontiers in Plant Science. 6, 399(2015).</li>
<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense-related+calcium+signaling+mutants+uncovered+via+a+quantitative+high-throughput+screen+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).</li>
<li>Rentel, M. C., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress-induced+calcium+signalling+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).</li>
<li>Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+mutagenesis+of+seed+and+vegetatively+propagated+plants+using+EMS%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).</li>
<li>Espina, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Phenotypic+Screening+of+an+Ethyl+Methane+Sulfonate+Mutant+Population+in+Soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 394(2018).</li>
<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+Genetics+in+Arabidopsis%3A+Finding+Mutations+that+Cause+Particular+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).</li>
<li>Maple, J., Moeller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaple%2C+J+%22Circadian+Rhythms.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology</a>. Rosato, E. , 362(2007).</li>
<li>Qu, L. J., Qin, G. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQu%2C+LJ+%22Arabidopsis+Protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology+%28Methods+and+Protocols%29%22">Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols)</a>. Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. 1062, (2014).</li>
<li>Leyser, H. M. O., Furner, I. J. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLeyser%2C+HMO+%22Arabidopsis%3A+the+Complete+Guide+%28Electronic+v.+1.4%29%22">Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4)</a>. Flanders, D., Dean, C. , AFRC Plant Molecular Biology II Programme. Norwich: UK. 9-10 (1993).</li>
<li>Pauly, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleus+together+with+the+cytosol+generates+patterns+of+specific+cellular+calcium+signatures+in+tobacco+suspension+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells.</a> Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).</li>
<li>Mithöfer, A., Mazars, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin-based+measurements+of+intracellular+Ca2%2B-signatures+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells.</a> Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).</li>
<li>Mehlmer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolset+of+aequorin+expression+vectors+for+in+planta+studies+of+subcellular+calcium+concentrations+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).</li>
<li>Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+calcium+signaling+in+Arabidopsis+involves+two+cellular+pools+and+a+change+in+calcium+signatures+after+acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation.</a> The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).</li>
<li>Sello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+Ca2%2B+fluxes+into+and+across+thylakoids+revealed+by+thylakoid-targeted+aequorin+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes.</a> Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).</li>
<li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast-localized+BICAT+proteins+shape+stromal+calcium+signals+and+are+required+for+efficient+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis.</a> New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+plant+receptor+for+extracellular+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a plant receptor for extracellular ATP.</a> Science. 343 (6168), 290-294 (2014).</li>
<li>Yuan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OSCA1+mediates+osmotic-stress-evoked+Ca2%2B+increases+vital+for+osmosensing+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis.</a> Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).</li>
<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lectin+S-domain+receptor+kinase+mediates+lipopolysaccharide+sensing+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).</li>
<li>Johnson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Poly%28A%29+Ribonuclease+Controls+the+Cellotriose-Based+Interaction+between+Piriformospora+indica+and+Its+Host+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+sensor+HPCA1+is+an+LRR+receptor+kinase+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis.</a> Nature. 578, 577-581 (2020).</li>
</ol>

ولا يوجد لدى أي من أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح يعلنه.

إن الطفرات التي تُنتج في نظام الإدارة البيئية هي أداة قوية لتوليد الطفرات في عدد السكان. كانت الشاشات الجينية الأمامية الكلاسيكية باستخدام نظام الإدارة البيئية أداة فعالة لتحديد الجينات الجديدة لسببين رئيسيين: أولاً، أنها لا تتطلب أي افتراضات مسبقة حول هوية الجينات، وثانياً، أنها لا تقدم أي تحيز. هناك عدة طرق لتوليد مجموعات فحص مثل EMS ، وإدخالات T-DNA ، والإشعاعات وما إلى ذلك. من بين جميع الطرق، فإن الطفرات القائمة على نظام الإدارة البيئية لديها مزايا قليلة على الطرق الأخرى. أولاً، من الأسهل توليد مجموعة من المتحولين عن...

وهناك تغيير في الكالسيوم السيتوسوليك (كاليفورنيا2 +) تركيز على إدراك من التحفيز الحيوي أو اللاأحيائي هو جيد درس مبكر إشارة الحدث الذي ينشط العديد من مسارات الإشارات1,2,3,4. وهناك خلية في حالته الراحة القاعدية يحافظ على أقل Ca2 + التركيز في السيتوسول وعزلات الزائد Ca2 + في مختلف العضيات داخل الخلايا وapoplast خارج الخلية مما يؤدي إلى حاد كاليفورنيا2 + التدرج5,6. عند إدراك الإشارة ، ترتفع مستويات Ca2+ في السيتوسول بسبب تدفق Ca2 + من مصادر خارج الخلية و / أو داخل الخلايا وتولد توقيع الكالسيوم محدد من المحفزات7،8،9. Ca2+ يتم تنشيط الارتفاعات في السيتوسول من قبل العديد من المحفزات، ولكن يتم الحفاظ على خصوصية من قبل مخازن متميزة الافراج عن كاليفورنيا2+، فريدة من نوعها كاليفورنيا2 + توقيع وبروتينات الاستشعار المناسبة10،11.
إن استخدام عامل الألكيلات، سلفونات الإيثيل-الميثان (EMS) في الطفرات الجينية هو أداة قوية في الشاشات الجينية الأمامية الكلاسيكية لتحديد الجينات المستقلة المتعددة المشاركة في العملية. EMS هو مطفرة كيميائية في الغالب تحفيز C إلى T و G إلى A التحولات بشكل عشوائي في جميع أنحاء الجينوم وتنتج 1 BP تغيير في كل 125 كيلوبايت من الجينوم. سوف EMS الطفرات تحفز التغييراتدلفين 1000 قاعدة واحدة، إما الإدراج / الحذف (InDel) أو متعددة الأشكال النوكليوتيد واحد (SNP) لكل الجينوم12. الطفرات الناجمة عن EMS هي طفرات متعددة نقطة مع تردد طفرة تتراوح بين 1/300 إلى 1/30000 لكل مكان. وهذا يقلل من عدد النباتات M1 اللازمة للعثور على طفرة في جين معين. ويستخدم عادة مجموعة من السكان البذور M1 من 2000-3000 للحصول على طفرات من الاهتمام في Arabidopsis ثالينا13,14.
Aequorin هي aequorin transgenics arabidopsis Columbia-0 (Col-0) النباتات ecotype التي تعبر عن p35S-apoaequorin (pMAQ2) في cytosol15. أيكورين هو بروتين Ca2+ ملزم يتكون من أبوبروتين ومجموعة اصطناعية تتكون من جزيء لوسيفيرين، coelenterazine. إن ربط Ca2+ إلى aequorin ، الذي يحتوي على ثلاثة مواقع CA2 + ملزمة EF-hands ، يؤدي إلى coelenterazine يتم أكسدةه وcyclized لإعطاء dioxetanone الوسيط ، يليه تغيير في التشكل من البروتين مصحوبًا بإطلاق ثاني أكسيد الكربون وكويليناراميد وحيد متحمس16. coelenteramide حتى تنتج تنبعث منها الضوء الأزرق (λماكس، 470 نانومتر) التي يمكن الكشف عنها من قبل17luminometer. وهكذا يمكن قياس الارتفاعات Ca2+ السريعة للغاية في الوقت الفعلي، واستغلالها للشاشات الجينية السريعة إلى الأمام. يهدف هذا البروتوكول إلى استخدام خصوصية استجابة الكالسيوم لتحديد اللاعبين الرئيسيين رواية التي تشارك في التوقيع Ca2+ . لتحقيق هذه المهمة، ونحن نستخدم EMS mutagenesis في aequorin المعدلة وراثيا وتحديد SNPs المرتبطة تغيير Ca2+ الإشارات. يحدد البروتوكول المسوخ التي لا تظهر أي ارتفاعات Ca2+ أو تخفضها عند إضافة المحفزات. ويمكن بعد ذلك تعيين هذه المسوخ لتحديد الجينات المسؤولة عن استجابة Ca2+ . الطريقة قابلة للتطبيق على أي نوع من المحفزات السائلة في النباتات التي تؤدي إلى ارتفاع كاليفورنيا2+ . منذ كاليفورنيا2 + الارتفاع هي واحدة من الاستجابات الأولى في مسار إشارة الدفاع النباتية، وتحديد مكونات استجابة المنبع يمكن أن توفر المرشحين للهندسة الوراثية لتطوير النباتات مرنة.

<table><tbody><tr><td>24 لوحة زراعة أنسجة البئر</td><td>Jetbiofil</td><td>11024</td><td>لزراعة الشتلات</td></tr><tr><td>96 صفيحة بيضاء بئر صفيحة</td><td>حرارية علمية</td><td>9502887</td><td>لقياسات مقياس الإضاءة</td></tr><tr><td>Aequorin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agropet</td><td>Lab Chem الهند</td><td></td><td>لنمو</td></tr><tr><td>النبات كلوريد الكالسيوم</td><td>فيشر Scientific</td><td>12135</td><td>للتفريغ الحل</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>PJK</td><td>55779-48-1</td><td>مجموعة الأطراف الاصطناعية ل aequorin</td></tr><tr><td>Ehtylmethane سلفونات</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0880-5G</td><td>لتكوين البذور</td></tr><tr>الكاشف<td>التحليلي للإيثانول</td><td>الكاشف التحليلي</td><td>1170</td><td>لمحلول التفريغ</td></tr><tr><td>حمض الهيدروكلوريك</td><td>Merck Life Sciences</td><td>1.93001.0521</td><td>محلول التعقيم</td></tr><tr><td>بيروكسيد الهيدروجين</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>15465</td><td>كمحفز لارتفاع الكالسيوم</td></tr><tr><td>صعود لومينوسكان</td><td>قياس</td><td></td><td>تلألؤ 5300172 إيكورين</td></tr> الحراري العلمي <tr><td>MES عازلة</td><td>هيميديا</td><td>RM1128-100G</td><td>نمو النبات</td></tr><tr><td>Murashige and skoog media</td><td>Himedia</td><td>PT021-25L</td><td>نمو النبات</td></tr><tr><td>هيدروكسيد الصوديوم</td><td>فيشر Scientific</td><td>27805</td><td>لتحييد EMS</td></tr><tr><td>هيبوكلوريت الصوديوم</td><td>Merck Life Sciences</td><td>1.93607.5021</td><td>محلول التعقيم</td></tr><tr><td>ثيوكبريتات الصوديوم</td><td>فيشر Scientific</td><td>28005</td><td>لغسل البذور في الخطوة 1.6</td></tr><tr><td>soilrite</td><td>Lab Chem India</td><td></td><td>لنمو النبات</td></tr><tr><td>الأواني المربعة</td><td>Lab Chem India</td><td></td><td>لنمو النبات</td></tr><tr><td>السكروز</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>S0389</td><td>نمو النبات</td></tr><tr><td>Taxim</td><td>Alkem</td><td>7180720</td><td>لإنقاذ الشتلات</td></tr></tbody></table>

إلى الأمام الشاشة الجينية باستخدام المعدلة وراثيا مراسل الكالسيوم أيكورين لتحديد أهداف جديدة في إشارات الكالسيوم

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

وكانت الشاشات الجينية الأمامية أدوات هامة في تحديد المكونات الجينية التي تنطوي عليها عدة مسارات بيولوجية غير متحيزة. أساس الشاشة هو توليد السكان المتحولين التي يمكن فحصها مع النمط الظاهري من الفائدة. EMS (سلفونات الميثان الإيثيلي) هو عامل الألكيلات الشائع الاستخدام لتحفيز الطفرة العشوائية في شاشة جينية أمامية كلاسيكية لتحديد جينات متعددة تشارك في أي عملية معينة. السيتوسوليك الكالسيوم (كاليفورنيا2+) ارتفاع هو مفتاح في وقت مبكر من مسار الإشارات التي يتم تنشيطها على الإدراك الإجهاد. ومع ذلك، فإن هوية المستقبلات والقنوات والمضخات وناقلات كاليفورنيا2+ لا تزال بعيدة المنال في العديد من أنظمة الدراسة. Aequorin هو بروتين مراسل الكالسيوم الخلوي المعزول من Aequorea فيكتوريا وsquly أعرب في arabidopsis. استغلال هذا، قمنا بتصميم شاشة الجينية إلى الأمام التي نحن EMS-mutagenized aequorin المعدلة وراثيا. جمعت البذور من النباتات متحولة ([م1و1و1') وفرز لل نوع ظاهريّة الفائدة كان نفذت في الفصل ([م2و2و2و2]." باستخدام بروتوكول قياس 96-77777777776-77766676-77766666766-7006، يمكن التعرف على العديد من المسوخ الجديدة التي لها استجابة مختلفة من الكالسيوم ويتم قياسها في الوقت الحقيقي.2+ يتم إنقاذ المسوخ مع النمط الظاهري من الفائدة ونشرها حتى يتم الحصول على سكان النباتات متحولة homozygous. يوفر هذا البروتوكول طريقة للشاشات الجينية الأمامية في Ca2+ خلفية مراسل وتحديد أهداف رواية Ca2+ المنظمة.

تم فحص السكان EMS لH2O2 الناجمة عن ارتفاع كاليفورنيا2+ . وكما نوقش آنفاً، تم فحص 12 شتلة من M2 من كل خط M1. في الشكل 3، يتم رسم خط M1 واحد مع كل لوحة تظهر 12 شتلة M2 فردية. ويستخدم أيكورين البرية من نوع كتحكم في مقارنة وتقييم استجابة متحولة. المتحول المتنحية يفصل في نسبة 1:7 (متحولة: غير متحولة). عند فحص 12 شتلة فردية لكل خط M1 ، يمكننا تحديد 1 أو 2 طفرات لكل خط. لقد حددنا 2 المسوخ المفترضة من 12 M2<...

تؤدي الشاشة الجينية الأمامية المستندة إلى ارتفاع Ca2+ كمطالعة إلى تحديد المكونات الوراثية المشاركة في مسارات الإشارة المعتمدة على الكالسيوم في النباتات.

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

والهدف من هذا البروتوكول هو تحديد الطريقة التي يمكن استخدامها لتحديد الجينات الجديدة التي تشارك في إشارات الكالسيوم. للقيام بذلك، ونحن نستخدم الشاشة الجينية الكلاسيكية إلى الأمام. إشارات الكالسيوم هو مسار استجابة دفاعية هامة في العديد من أنظمة النباتات.من أجل تحديد الجينات المشاركة في هذا المسار ، استخدمنا الشاشة الجينية الكلاسيكية إلى الأمام. في هذه الطريقة، سيتم استخدام EMS كعامل الألكيلات لإدخال طفرات عشوائية في أنظمة النباتات. ويمكن بعد ذلك استخدام جيل المتحولين المتقدمين للفحص من أجل نمط ظاهري من الاهتمام.بمجرد تحديد النمط الظاهري من الاهتمام، يمكن تعيين الجين السببية. في هذه الدراسة، ونحن نستخدم نموذج نبات Arabidopsis التي لديها مراسل الكالسيوم ايكورين في طيفه. تزن 150 ملغ بذور من أيكورين لEMS الطفرات وأخرى 150 ملغ بذور لاستخدامها كتحكم.نقل البذور إلى أنبوب فالكون 50 مل وإضافة 2٪ EMS أو الماء autoclaved. أثناء استخدام EMS، كن حذرا لأنه مسرطنة. وينبغي ارتداء التروس الواقية أثناء استخدام نظام الإدارة البيئية وينبغي منع أي نوع من الانسكابات.ختم أنابيب فالكون مع البارافين والتفاف عليه رقائق الألومنيوم. تدوير نهاية الأنبوب على نهاية لمدة 18 ساعة في درجة حرارة الغرفة. السماح للبذور لتسوية وإزالة حل EMS بعناية والتخلص في حاوية النفايات التي تحتوي على نفايات صوديوم صوديوم واحد.اغسل البذور المُمَتَمَّعة جيداً بـ 40 مل من الماء المُقلَد الأوتوكامبوت ثماني مرات على الأقل. للغسل النهائي، إضافة 100 ملليمولار ثيوسلفات الصوديوم وشطف ثلاث مرات على الأقل لإزالة آثار EMS. نقع البذور في 40 مل من الماء autoclaved لمدة ساعة واحدة لنشر EMS من البذور ومن ثم وضعها على ورق Whatman حتى يجف تماما.نقل البذور إلى Eppendorf واحتضان في أربع درجات مئوية لمدة يومين إلى أربعة أيام للتقسيم الطبقي. نقل كل من البذور المطفرة والبذور المعالجة بالماء إلى التربة ونقلها إلى غرف النمو مع فترة تصوير داكنة لمدة 16 ساعة وثماني ساعات عند 22 درجة مئوية ورطوبة نسبية بنسبة 70٪. من أجل تحديد ما إذا كان الطفرات الناجحة، والبحث عن قطاعات الكلورو.لقد استخدمنا طريقة جمع البذور الأحادية المستندة إلى النسب ويتم إعطاء كل مصنع M1 رقمًا فريدًا. عند النضج، يتم حصاد البذور من هذه النباتات المتحولة الفردية وتخزينها كلخطوط M1 الفردية. يتم استخدام تعقيم البذور الإنتاجية العالية وبروتوكول جذر النبات المائية، وتكييفها من Ranf وآخرون.في اليوم الأول، ضع ما يقرب من 12 إلى 15 M2 البذور لكل M1 سطر واحد في الآبار الفردية من لوحة ثقافة الأنسجة 24 جيدا وتعقيم باستخدام هيبوكلوريت الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك حل بنسبة ثلاثة إلى واحد. هذا يطلق غاز الكلور الذي يعقم البذور. اترك الطبق ليتبخر غاز الكلور المتبقي تمامًا.بعد التعقيم، إضافة نصف قوة السائل MS وسائل الإعلام إلى الآبار الفردية وطبقة البذور لمدة يومين إلى أربعة أيام في أربع درجات مئوية، ومن ثم نقل البذور إلى غرفة النمو مع فترة الصورة من 10 ساعة ضوء و 14 ساعة الظلام في 22 درجة مئوية، 70٪ الرطوبة النسبية. في اليوم 14، مرة واحدة الشتلات هي ثمانية إلى 12 يوما من العمر، مكان 12 شتلات M2 من كل خط على حدة في لوحة مضيئة 96 جيدا. بعد نقل الشتلات، إضافة 150 ميكرولترات من خمسة محلول كولينترازين الدقيقة في الآبار الفردية وتخزينها في الظلام عند 21 درجة مئوية لمدة ثماني ساعات.Coelenterazine هي مجموعة اصطناعية التي ترتبط apoaequorin لتشكيل aequorin وظيفية. Coelenterazine هو ضوء حساس ومن ثم يتم تخزينها في زجاجات داكنة اللون محمية من الضوء. في اليوم التالي، المسوخ الشاشة باستخدام بيروكسيد الهيدروجين كحافز وقياس ارتفاع الكالسيوم اللاحقة.وللت وقياس 24 بئرًا في وقت واحد، يتم إجراء برنامج حركي آلي، يتضمن قياس الخلفية لمدة دقيقة واحدة، يليه إضافة قياس تحفيزي لمدة 10 دقائق، يليه حقن التفريغ 150 ميكرولتر وقياس لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. وأي تصريف لابنة aequorin سيتم تضمينها في القراءة لتحديد كمية الكالسيوم المقاسة وكتحكم إضافي للـ aequorin الوظيفية. القراءات المقدمة من الطريقة المذكورة أعلاه في وحدات الضوء النسبي.لحساب تركيز أيونات الكالسيوم السيتوسوليك، يتم استخدام معادلة تركيز سبق وصفها التي قدمها الإيجار و Knight في عام 2004، والتي تم وصفها في البروتوكول. تضاف وحدات الـ RLUs التي تم الحصول عليها من مقياس اللمعان إلى المعادلة لحساب تركيز أيونات الكالسيوم. ثم يتم رسم قيم أيونات الكالسيوم السيتوسوليك التي تم الحصول عليها رسومًا رسومية ضد عنصر تحكم من النوع البري لتحديد المسوخ البيروكسيد الهيدروجيني المفترضة إلى استجابة الكالسيوم.وهذا نتيجة تمثيلية للبروتوكول المبين. لقد أظهرنا خط M1 واحد مع 12 شتلة فردية تم قياسها لارتفاع تركيز أيونات الكالسيوم. يشير الخط الأخضر في الرسم البياني إلى أيكورين من النوع البري الذي تم قياسه مع المسوخ.الأحمر هو متوسط جميع الشتلات 12، والخط الأسود هو شتلات M2 الفردية تقاس لارتفاع أيون الكالسيوم. ثم يتم إنقاذ الشتلات التي تظهر استجابة مخفضة للغاية لتطبيق بيروكسيد الهيدروجين. ثم يتم إعادة تأكيد المسوخ التي تم إنقاذها في الجيل التالي، يليها رسم خرائط لتحديد الجينات السببية.يجب توخي الحذر عند استخدام EMS كمتاجن لأنه مادة مسرطنة. وينبغي ارتداء العتاد الواقي في جميع الأوقات، وينبغي التعامل مع أي انسكاب يتم مع الممارسات المختبرية الجيدة. بالإضافة إلى ذلك، عند القيام بمجموعة من البذور على أساس النسب، ينبغي حصاد النباتات الفردية مع أقصى قدر من العناية بحيث لا يكون هناك خلط أي بذور في أي مرحلة.وهذا سوف يساعد المرء على العودة وتتبع النبات الأم، وهو نبات متحولة homozygous. بالإضافة إلى ذلك، بما أن هذه الطريقة لا تدخل أي تحيز أو أي افتراضات سابقة في طريقة الفحص، يمكن استخدامها لشرط أو أكثر لتحديد نوع ظاهري من الاهتمام. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحديد جينات مستقلة متعددة باستخدام نفس البروتوكول.البروتوكول سهل الاستخدام منذ مع جرعة صغيرة، يمكن أن يكون هناك عدد كبير من النباتات mutagenized. ويمكن استخدام هذا العدد الهائل من النباتات المتحولة لعدة مجموعات وعدد من الحالات ولتحديد عدة جينات. ويمكن تحديد فقدان جزئي للوظيفة، أو وظيفة معدلة، أو فقدان كامل للوظيفة، أو أيضا وظيفة جينية تأسيسية من خلال هذه الطريقة.وينبغي أن يكون التخطيط مهمة سهلة بالنظر إلى التقدم في تكنولوجيات رسم الخرائط في السيناريوهات الحالية. ويمكن استخدام نظام رسم الخرائط القائم على نوفو، والتآمر العنصري القائم على SNP والعديد من الأنظمة الأخرى لتحديد الجين السببي الذي يسبب النمط الظاهري من الاهتمام. ونظرا لقابلية تطبيق هذه الطريقة، فإنه يمكن استخدامها ليس فقط على النباتات نموذج Arabidopsis، ولكن النباتات نموذج أخرى أيضا شريطة أن يمكن إنشاء النمط الظاهري من قراءات الفائدة.

forward-genetic-screen-using-transgenic-calcium-reporter-aequorin-to

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يقدم هذا الفيديو المفاهيم الكامنة وراء تصوير الكالسيوم ويتضمن مثالا على بروتوكول التصوير بفاصل زمني للديدان الموجودة في آبار الاغاروز المصبوبة.

تصوير الكالسيوم: طريقة لتصور النشاط العصبي في C. ايليجانس الحي

مع صغر الجسم التشريح العصبي شفافة موثقة جيدا، ومجموعة من التقنيات الجينية قابلة...

الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس

القائم على مضان الكالسيوم مقايسة تعبئة هنا وصف هو عكس الصيدلة نظام الفرز المتوسطة الإنتاجية للتعرف على تفعيل وظيفيا يجند (ق) من الأيتام G-البروتين يقترن مستقبلات (GPCRs).

توصيف G مستقبلات البروتين يقترن بها الكالسيوم تعبئة الفحص القائم على الإسفار

هنا نقدم الرواية كا 2+ -imaging النهج باستخدام مراسل إضاءة الحيوية. يستخدم هذا النهج تنصهر بناء GFP-aequorin الذي يربط الكالسيوم 2+ وتنبعث الضوء، مما يلغي الحاجة لالإثارة الخفيفة. كبير يسمح هذا الأسلوب التصوير المستمر الطويل، والوصول إلى هياكل الدماغ العميقة وقرار زمنية عالية.

في فيفو الدماغ أسلوب التصوير النهج القائم على الكالسيوم إضاءة الحيوية المؤشر GFP-aequorin

يصف هذا البروتوكول استخدام جينياً المرمزة Ca2 + الصحفيين لتسجيل التغييرات في النشاط العصبي في التصرف ايليجانس كاينورهابديتيس الديدان.

تصوير راتيوميتريك الكالسيوم من الخلايا العصبية الفردية في التصرف ايليجانس كاينورهابديتيس

يمكننا وصف النهج للتلاعب بالجينات في النظام النموذجي التطوري مكسيكي أستياناكس. ويرد وصف ثلاث تقنيات مختلفة: ترانسجينيسيس Tol2 بوساطة، وتستهدف التلاعب جينوم استخدام كريسبر/Cas9، وضربه قاضية للتعبير باستخدام مورفولينوس. وينبغي تيسير هذه الأدوات التحقيق المباشر للجينات الكامنة وراء الاختلاف بين أشكال السطح والكهوف السكنية.

التلاعب بالجينات الدالة في كافيفيش المكسيكي

نقدم بروتوكولًا من جزئين يجمع بين تصوير الكالسيوم الفلوري مع التهجين في الموقع ، مما يسمح للمجرب بربط أنماط نشاط الكالسيوم بملفات تعريف التعبير الجيني على مستوى خلية واحدة.

تصوير الكالسيوم الفلوري والتهجين في الموقع اللاحق لتوصيف السلائف العصبية في زينوبوس laevis

نحن نصف هنا، إنشاء وتطبيق TG (Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J (يشار إليه باسم αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 أدناه) خط مراسل الماوس لتقييم إعادة برمجة القلب. يتم تحويل الخلايا الليفية القلبية الوليدية (NCFs) المعزولة عن سلالة الماوس إلى خلايا قلبية مستحثة (iCMs) ، مما يسمح بتقييم مناسب وفعال لكفاءة إعادة البرمجة والنضج الوظيفي ل iCMs عن طريق تدفق الكالسيوم (Ca2+).

في المختبر تقييم إعادة برمجة القلب عن طريق قياس تدفق الكالسيوم القلب محددة مع مراسل GCaMP3

يصف هذا البروتوكول التحكم البصري الكامل ومراقبة النشاط الخلوي المثار في الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC (iPSC-CMs) لفحص الأدوية عالية الإنتاجية واختبار السمية. يتم عرض القياس الكمي متعدد المعلمات لأنماط النمط الظاهري في الزمان والمكان. يتم إثبات الآثار طويلة الأجل للعقاقير على مدى ساعات ، أو القياسات المتسلسلة على مدى أيام.

التحكم البصري عالي الإنتاجية وتسجيل إشارة الكالسيوم في الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC لاختبار السمية وفحص الأدوية المظهرية

في هذا العمل ، تم وصف مقايسة مضان الكالسيوم عالية الإنتاجية داخل الخلايا لألواح 384 بئرا لفحص مكتبات الجزيئات الصغيرة على مستقبلات البروتين G المقترنة المؤتلفة (GPCRs). يتم التعبير عن الهدف ، مستقبل كينين من قراد حمى الماشية ، Rhipicephalus microplus ، في خلايا CHO-K1. يحدد هذا الفحص الناهضات والخصوم باستخدام نفس الخلايا في مقايسة "الإضافة المزدوجة" الواحدة.

مقايسة مضان الكالسيوم "مزدوجة الإضافة" للفحص عالي الإنتاجية لمستقبلات البروتين G المؤتلف

الأطراف الاصطناعية للشبكية لديها القدرة على توليد تصورات بصرية. للمضي قدما في تطوير أطراف اصطناعية جديدة ، هناك حاجة إلى طرق خارج الجسم الحي لاختبار الأجهزة قبل الزرع. تقدم هذه المقالة بروتوكولا شاملا لدراسة نشاط الكالسيوم في طبقة خلايا العقدة الشبكية عند تعرضها للتحفيز الكهربائي.

تصوير الكالسيوم في شبكية العين المسطحة المحفزة كهربائيا

اكتشف طريقة الفحص الجيني الأمامي لتحديد الجينات المشاركة في إشارات الكالسيوم في نبات Arabidopsis باستخدام تقنية التطفير العشوائي EMS والمستحضر الحيوي أيكورين.

إلى الأمام الشاشة الجينية باستخدام المعدلة وراثيا مراسل الكالسيوم أيكورين لتحديد أهداف جديدة في إشارات الكالسيوم

استكشف المزيد من الفيديوهات