مجتمعة في فيفو التشريحية والوظيفية تتبع من محطات الغلوتامات منطقة البطن في قرن آمون

يحلل البروتوكول الحالي طريقة ميسورة التكلفة ومباشرة للتتبع التشريحي العصبي والفيزيولوجي الكهربي للدوائر العصبية في الجسم الحي. تسمح هذه التقنية برسم خرائط للمحطات المساعدة من مجموعة خلايا عصبية معينة إلى موقع مستهدف. وبالمثل ، يمكن التحقق من الخريطة التشريحية لهذه المحطات عن طريق التحفيز البصري الوراثي أثناء التسجيل خارج الخلية في الموقع المستهدف.

يمكن تطبيق هذا البروتوكول لدراسة الدوائر العصبية المتعددة المرتبطة بالوظيفة الحسية والحركية والمعرفية. يتطلب إجراء هذا الإجراء بعض المعرفة بالجراحة التجسيمية للقوارض والتعامل مع الأقطاب الكهربائية العصبية الحساسة. اتصال نظام التسجيل لمنع الضوضاء في التسجيلات.

يسلط العرض المرئي الضوء على الخطوات الأساسية في إعداد نظام LED ميسور التكلفة لعلم البصريات الوراثي في الجسم الحي. كما يوضح كيفية توصيل مكبر الصوت ببرنامج تشغيل LED للتسجيل والتحفيز المتزامنين في ماوس مخدر. ضع وسادة تسخين على الإطار التجسيمي بحيث يكون جسم الماوس مستلقيا عليه مما يساعد في الحفاظ على درجة حرارة جسمه طوال العملية ، ثم قم بتثبيت الرأس برفق على الجهاز التجسيمي.

جهز المنطقة الجراحية عن طريق تنظيفها أولا بمحلول اليود ثم بالكحول لإزالة اليود. بعد ذلك ، ضع الليدوكائين الموضعي لمنع الإحساس على فروة الرأس. ثم باستخدام مشرط ، قم بعمل شق خط الوسط يمتد من المنطقة الأمامية إلى المنطقة القذالية.

بالنسبة للمنطقة السقيفية البطنية أو حقن VTA ، ضع حقنة إبرة نقطة حادة فائقة الدقة عند سالب 3.08 ملم أمامي خلفي و 0.5 ملم إحداثيات جانبية وسطية بالنسبة إلى البريجما. استخدم أداة حفر لحفر ثقب بمقدار ملليمتر واحد في الجمجمة عند الإحداثيات المحددة. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لتثبيت حامل الحقنة على جهاز معالجة دقيقة واملأ المحقنة بالماء المقطر المزدوج لتنظيف واختبار تدفق السوائل.

ثم قم بتوزيع الماء لاختبار تدفق المحقنة. قم بإذابة كميات من الفيروس المرتبط بالغدة أو كوكتيل AAV على الجليد. املأ المحقنة المركبة ب 1،000 نانولتر من محلول AAV وقم بتوزيع 10 نانولترات من المحلول لتأكيد تدفق السائل.

استخدم المعالج الدقيق لخفض الإبرة إلى موقع الحقن وحقن 600 إلى 800 نانولتر من AAV في VTA ، مما يوفر المحلول بمعدل 60 نانولترا في الدقيقة. بعد ثلاثة أسابيع من حقن AAV ، قم بلصق رأس على إطار تجسيمي كما هو موضح سابقا وقم بإجراء بضع القحف لفضح الجافية. استخدم أداة حفر لإزالة جزء من العظم الجداري.

تحت مجهر التشريح ، استخدم طرف إبرة مثني عيار 27 لاستئصال الأمفية المكشوفة ، مع الحرص على عدم تفكيك غطاء التقشير الرقيق والأنسجة القشرية في هذه المنطقة. ضع قطرات من السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي على منطقة حج القحف لمنع الجفاف. حفر ثقب في العظم القذالي لتثبيت المسمار الأرضي وتوصيل سلك أرضي من الفولاذ المقاوم للصدأ.

قبل خفض القنية ، قم بتوصيل كابل الألياف الضوئية بمصدر LED مقترن بالألياف. قم بخفض الألياف البصرية التي يبلغ قطرها 400 ميكرومتر في VTA بإحداثيات AP سالب 3.08 ملم و ML 0.5 ملم. باستخدام معالج دقيق ، ضع مواقع ملامسة القطب الكهربائي في طبقة الخلية الهرمية ل CA1.

لمزامنة نبضة الضوء مع التسجيل العصبي ، قم بتوصيل برنامج تشغيل LED والاستيراد الرقمي لوحدة التحكم في التسجيل بنبض منطقي ترانزستور ترانزستور باستخدام مقسم BNC. اضبط المقبض لتحديد الكثافة الفعالة التي يمكن أن تولد استجابة دون إنتاج قطع أثرية كهروضوئية وقم بتوصيل الأرض على الجمجمة بالأرض على المحول. قم بتوصيل مرحلة رأس مكبر الصوت بوحدة التحكم في التسجيل عبر كابل واجهة طرفية تسلسلية وتحقق من مصابيح LED الملونة على منافذ وحدة التحكم في التسجيل.

تشير مصابيح LED الخضراء والصفراء إلى الجهد المناسب على لوحة مكبر الصوت المتصلة ويشير مؤشر LED الأحمر إلى التحكم في مرحلة رأس البرنامج العام. بعد تشغيل البرنامج ، حدد تنسيق ملف البيانات وقم بتغيير اسم الملف. قم بالتبديل إلى المنفذ الخاص بمرحلة الرأس المتصلة وانقر فوق تعطيل الكل على المنفذ إذا كان القطب يحتوي على قنوات أقل من مرحلة الرأس.

حدد العدد المناسب من القنوات التي سيتم عرضها على الشاشة. لالتقاط الطابع الزمني TTL للتسجيل العصبي المتزامن والطابع الزمني الذي يتم تشغيله بنبض الضوء ، انقر فوق الواردات الرقمية وقم بتمكين الرقمية في الصفر واحد. يجب أن يتوافق هذا مع اتصال BNC على الواردات الرقمية لمكبر الصوت.

اضبط المقياس الزمني ومقياس الجهد لعرض الشكل الموجي المناسب وحدد معدل أخذ العينات ، مع الأخذ في الاعتبار أن معدل أخذ العينات الأعلى وعدد القنوات سيزيد من حجم الملف. بعد ذلك ، قم بتعيين عرض النطاق الترددي لمكبر الصوت لتسجيل وحدة واحدة. تم استخدام تردد قطع 300 إلى 5,000 هرتز هنا.

للحصول على صوت سبايك ، انقر فوق الصوت التناظري وقم بتمكين المنفذ التناظري. ثم اضبط الكسب وكاتم الصوت للحصول على الصوت الأمثل. لمزامنة تسجيل مكبر الصوت وقطار نبض الضوء ، انقر فوق علامة التبويب العرض وقم بتمكين علامة العرض.

قم بالتبديل إلى القناة المناسبة التي تتوافق مع اتصال BNC وأعد فحص المنافذ للتأكد من تمكين قنوات التسجيل والقناة الرقمية لالتقاط المسامير العصبية والطوابع الزمنية لنبض الضوء. انقر فوق نطاق السنبلة لعرض أشكال الموجة التي تشكل قطار السنبلة المسجل باستمرار. استخدم الماوس لتعيين عتبة الأشكال الموجية المراد عرضها.

ثم افحص RMS لتحديد مستوى الضوضاء في التسجيل الخاص بك. تم التحقق من تعبير الفيروس المرتبط بالغدة عن طريق التصوير المناعي الفلوري ل EYFP في المنطقة السقيفية البطنية للفئران بعد 21 يوما من الحقن. تم استخدام التصوير الفلوري أيضا للكشف عن إسقاطات غلوتامات VTA قبل التشابك في طبقات الحصين DG و CA3 و CA1.

بمجرد اكتشاف نشاط الجهد خارج الخلية ، تم تسجيل نشاط خط الأساس لمدة 10 دقائق تقريبا قبل تشغيل نبضة الضوء بالتردد المطلوب. هذا جعل من الممكن مقارنة معدلات إطلاق النار أو الانفجار للخلايا العصبية المفترضة CA1 قبل وبعد التحفيز الضوئي للجلوتامات VTA. لدعم هذه النتيجة ، كشفت المقارنة الإحصائية لمعدلات إطلاق شبكة CA1 قبل وبعد التحفيز الضوئي عن زيادة كبيرة لفترة ما بعد التحفيز.

أظهر التحليل اللاحق للقطار النقطي للكشف عن الرشقات النارية أيضا زيادة في معدل الانفجار للخلايا العصبية الهرمية المفترضة CA1 بعد التحفيز الضوئي. تم تحديد الاستجابة للمحاكاة الضوئية عن طريق تألق تعبيرات مراسل AAV في مواقع التحفيز. أيضا ، يجب أن يكون وصف الارتباط بموقع التسجيل للوحدات المفترضة المستجيبة.

يمكن أيضا تنفيذ هذه الطريقة في الفئران المستيقظة التي تقوم بمهام سلوكية. في هذه الحالة ، يجب استخدام المجسات المزمنة القابلة للزرع وقنية الألياف البصرية. ستسمح هذه التقنية بتتبع قوي للدوائر العصبية من خلال مزيج من التوزيع الطرفي قبل المشبكي في الموقع المستهدف وتعديل المحطات قبل المشبكية للكشف عن استجابة الموقع المستهدف في الجسم الحي.