تقييم موت الخلية باستخدام الخلايا الخالية من البروبيوتيك في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية القولون والمستقيم
يونيو 13, 2020
هنا يتم تقديم طرق لفهم الآثار المضادة للسرطان من اللاكتوباكيلوس الخلايا الخالية من الخلايا الفائقة (LCFS). تظهر خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم وفيات الخلايا عند علاجها باستخدام LCFS في الثقافات ثلاثية الأبعاد. يمكن تحسين عملية توليد كرويدات اعتمادا على السقالة وأساليب التحليل المقدمة مفيدة لتقييم مسارات الإشارات المعنية.
تم تحسين هذا البروتوكول لتسهيل التحقيق في التأثير المضاد للسرطان للطافي الخالي من الخلايا اللبنية في أنواع متعددة من كرويات خلايا سرطان القولون. هذه التقنية هي النهج الأول الذي يبحث في التأثيرات المضادة للسرطان ل LCFS على الكرات الكروية لسرطان القولون في ظل ظروف تقليد في الجسم الحي. ابدأ بوضع صفيحة أجار MRS المعقمة بالأوتوكلاف في غرفة لاهوائية من الهيدروجين بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 20 جزءا في مليون أكسجين وتلقيح اللوحة بمخزون بكتيري Lactobacillus المذاب حديثا.
أضف ملليلترتين إلى ثلاثة ملليلترات من مرق MRS ، المكمل ب l-cysteine إلى الأنبوب وأغلق الأنبوب بسدادة مطاطية من البوتيل وغطاء الأنبوب. بعد ذلك ، استخدم حلقة لجمع مستعمرة واحدة ووضع المستعمرة في أنبوب استزراع سعة 1.5 مليلتر يحتوي على 500 ميكرولتر من PBS. أعد تعليق المستعمرة بشكل متجانس داخل المحلول الملحي وقم بتحميل المعلق البكتيري بالكامل في حقنة سعة مليلتر واحد.
أدخل الإبرة في وسط غطاء أنبوب الثقافة وقم بتوصيل المستعمرة إلى الوسط. ضع المزرعة في حاضنة اهتزاز عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، و 200 دورة في الدقيقة. بعد يومين ، قم بقياس OD620 للثقافة على مقياس الطيف الضوئي.
عندما يساوي OD620 اثنين ، قم بترسيب البكتيريا عن طريق الطرد المركزي وغسل بيليه البكتيريا باستخدام PBS. بعد الطرد المركزي الثاني ، قم بتعليق البكتيريا في أربعة ملليلتر من RPMI 1640 ، مع استكمال مصل بقري الجنين بنسبة 10٪ بدون مضادات حيوية ووضع البكتيريا في حاضنة الاهتزاز لمدة أربع ساعات بمعدل 100 دورة في الدقيقة. في نهاية الحضانة ، قم بتقطيع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي وتصفية المادة الطافية المستردة من خلال مصفاة 0.22 ميكرون لتخزين 80 درجة مئوية تحت الصفر.
لتحضير خطوط الخلايا السرطانية للقولون والمستقيم لتكوين كروي ، قم بزراعة الخلايا ذات الأهمية كطبقات أحادية في أطباق بتري 100 ملم في حاضنة زراعة الخلايا. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 70 إلى 80٪ ، اغسل الثقافات مرتين بأربعة ملليلتر من PBS لكل غسلة قبل فصل الخلايا بمليلتر واحد من 0.25٪ trypsin-EDTA لكل طبق. بعد دقيقتين ، تحقق من عدم التفكك تحت المجهر الضوئي.
إذا انفصلت الخلايا ، فقم بتحييد التفاعل الأنزيمي بخمسة ملليلتر من وسط النمو. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في أنبوب مخروطي واحد سعة 15 ملليلتر لكل مزرعة خلية وأعد تعليق الكريات برفق بثلاثة ملليلتر من وسط النمو لكل أنبوب. بعد ذلك ، احسب عدد الخلايا القابلة للحياة عن طريق استبعاد التريبان الأزرق.
بعد العد ، قم بتخفيف الخلايا إلى مرة إلى ضعفين 10 إلى الخلايا الخامسة لكل تركيز مليلتر في وسط جديد وأضف ميثيل السليلوز إلى الخلايا إلى تركيز نهائي 0.6٪. انقل الخلايا إلى خزان معقم واستخدم ماصة متعددة القنوات لتوزيع 200 ميكرولتر من الخلايا على كل بئر من صفيحة صغيرة القاع مستديرة ذات 96 بئرا منخفضة للغاية. بعد ذلك ، ضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 24 إلى 36 ساعة قبل التحقق من تكوين الكرات بواسطة المجهر الضوئي.
لعلاج LCFS ، قم بتخفيف محلول مخزون LCFS المذاب المحضر بشكل متسلسل في وسط نمو جديد إلى تركيزات 25 و 12.5 و 6٪ واستخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية بعناية من كل بئر من مزارع خط خلايا سرطان القولون والمستقيم المطلي. بعد ذلك ، أضف برفق 200 ميكرولتر من وسط النمو المكملة ب LCFS في ثلاث نسخ لكل مجموعة من الخلايا السرطانية وأعد اللوحة إلى الحاضنة لمدة 24 إلى 48 ساعة إضافية. يحول تركيز ميثيل السليلوز البالغ 0.6٪ خلايا خط الخلايا السرطانية المختبرة إلى كرويات مضغوطة ، مما يشير إلى أنه يمكن إنشاء الكرات من عدة أنواع من سرطان القولون والمستقيم باستخدام هذا البروتوكول.
تظهر الكرات المزروعة بنسبة 25٪ LCFS أسطحا معطلة وقابلية انخفاضية للخلايا بطريقة تعتمد على الجرعة. في الواقع ، تظهر الخلايا المزروعة في LCFS مستويات أعلى من التعبير عن يوديد البروبيديوم مقارنة بخلايا التحكم القابلة للحياة. يمكن أيضا إجراء تحليل PCR للنسخ العكسي ، والنشاف الغربي وتحليل الملحق الخلوي للتدفق V / 7-AAD لتقييم آثار LCFS على موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية.
تأكد من التعامل مع الكرات برفق عند إزالة وسط النمو حيث يمكن أن تنكسر الكرويات بسهولة ، مما يجعل من المستحيل ملاحظة تأثير علاج LCFS. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء فحوصات صلاحية الخلية ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي ، والنشاف الغربي ، وتحليل FACS لتوصيف التأثير المضاد للسرطان ل LCFS بمزيد من التفصيل.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يقدم هذا المقال بروتوكولاً لاستقصاء التأثيرات المضادة للسرطان لسائل طافٍ خالٍ من الخلايا لـ Lactobacillus (LCFS) على كرويات سرطان القولون. وتعمل الدراسة على تحسين عملية توليد الكرويات وتقييم مسارات الإشارات المتورطة في موت الخلايا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- أبحاث السرطان
خلفية علمية
- تُعرف بكتيريا Lactobacillus بفوائدها الصحية المحتملة.
- يمكن أن تحتوي الرواسب الطافية الخالية من الخلايا على مركبات ذات نشاط بيولوجي.
- لا يزال سرطان القولون والمستقيم يمثل تحدياً صحياً كبيراً.
- تحاكي المزارع الخلوية ثلاثية الأبعاد (3D) الظروف الحيوية داخل الجسم بشكل أفضل.
الغرض من الدراسة
- لاستكشاف التأثيرات المضادة للسرطان لـ LCFS على الكريات السرطانية في القولون.
- لتحسين تقنيات توليد الكريات.
- لتحليل مسارات التأشير المتورطة في التأثيرات الملحوظة.
الطرق المستخدمة
- تحضير أطباق آجار MRS في غرفة لاهوائية.
- تلقيح الأطباق بمخزون بكتيريا Lactobacillus.
- زراعة البكتيريا في مرق MRS المدعم بـ l-cysteine.
- جمع المستعمرات البكتيرية وإعادة تعليقها من أجل المعالجة.
النتائج الرئيسية
- أظهرت الخطوط الخلوية لسرطان القولون والمستقيم موتاً خلوياً عند معالجتها بـ LCFS.
- أدت طرق توليد الكريات الخلوية المحسنة إلى تحسين النتائج التجريبية.
- تم تحليل مسارات التأشير المشاركة في الموت الخلوي بشكل فعال.
- تقدم الدراسة نهجاً جديداً لأبحاث علاج السرطان.
الاستنتاجات
- يظهر LCFS واعدة كعامل محتمل مضاد للسرطان.
- تعد تقنيات الزراعة ثلاثية الأبعاد ضرورية للنمذجة الدقيقة.
- هناك حاجة إلى مزيد من الأبحاث لفهم الآليات المعنية بشكل كامل.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح هذا البروتوكول لفرق البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية تقييم السوائل الطافية المشتقة من البروبيوتيك للكشف عن النشاط المضاد للسرطان في نماذج ثلاثية الأبعاد لسرطان القولون والمستقيم ذات صلة فسيولوجية. ومن خلال استخدام السائل الطافي الخالي من خلايا Lactobacillus fermentum (LCFS) في مستنبتات كروية مستقرة، تدعم هذه الطريقة تقليل المخاطر الآلية للمركبات المرشحة من المنتجات الطبيعية، وتعزز الثقة التنبؤية في جهود التحقق من الهدف. ويربط هذا النهج بين مرحلة المسح في مرحلة الاكتشاف والأهمية الترجمية من خلال نمذجة تفاعلات البيئة الدقيقة للأمعاء التي تؤثر على حيوية الخلايا السرطانية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: استقصاء الفرضيات العلاجية المتعلقة بالمستقلبات الميكروبية وتأثيرها على مسارات موت خلايا سرطان القولون والمستقيم.
- القيمة التشغيلية: تفعيل التحقق الوظيفي من الأهداف من خلال قراءات الحيوية المعتمدة على الجرعة في نماذج الكرويات ثلاثية الأبعاد (3D spheroid models).
- القيمة التنبؤية: دعم فرز محفظة المشاريع من خلال ربط الموت الخلوي المبرمج الناجم عن LCFS بعلامات جزيئية قابلة للقياس عبر qRT-PCR وWestern blot وFACS.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تحضير أنظمة بيولوجية تم التحقق من صحتها لفحص المركبات اللاحق باستخدام تكوين كرويات قابل للتكرار في أطباق فائقة انخفاض الالتصاق.
- المخرجات الكمية: توليد بيانات الاستجابة للجرعة (25%، 12.5%، 6% LCFS) مما يسمح بتقدير IC50 ونمذجة العلاقة بين البنية والنشاط.
- القابلية للتوسع: استخدام تنسيق 96-well المتوافق مع المناولة الآلية للسوائل وفحص الحيوية عالي الإنتاجية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: نمذجة الفسيولوجيا المرضية لسرطان القول والمستقيم باستخدام كرويات خلوية مشتقة من المرضى أو خطوط خلوية مستقرة تعكس بنية الورم داخل الجسم.
- الاستمرارية الترجمية: ربط نتائج الاكتشاف بالتحقق قبل السريري من خلال الحفاظ على ظروف استنبات ثلاثية الأبعاد متسقة عبر مراحل المقايسة.
- قرارات معدلة وفقاً للمخاطر: تسهيل وضع معايير القبول أو الرفض (go/no-go) بناءً على تحريض الموت الخلوي المبرمج وعتبات الحيوية الملحوظة في المستنبتات الخلوية المشتركة للكرويات.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تدمج هذه الطريقة ضمن سير عمل الاكتشاف المبكر، وذلك في المرحلة التي تلي تحديد الهدف وتسبق تحسين المركبات الرائدة، مما يوفر نظاماً ذا صلة بالمرض لتقييم السوائل الطافية ذات النشاط الحيوي من المصادر الميكروبية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بآليات مكافحة السرطان الميكروبية وتوضيح المسارات في النماذج ثلاثية الأبعاد التي تتنبأ بالاستجابات داخل الجسم الحي بشكل أفضل.
- الفحص: توفر توحيد المقايسات وقابليتها للتكرار من خلال بروتوكولات موحدة لتكوين الكريات وتطبيق علاج LCFS.
- التحليلات: تتيح قياسات كمية للمتغيرات التابعة (الحيوية، وعلامات موت الخلايا المبرمج) التي تدعم المقارنة الإحصائية بين ظروف العلاج والخطوط الخلوية.
- الأبحاث الانتقالية: تحافظ على الاستمرارية من الفحص القائم على الكريات إلى التحقق قبل السريري من خلال الحفاظ على دقة المزرعة ثلاثية الأبعاد.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لفحص السوائل الطافية للمعينات الحيوية، أو مستخلصات الأغذية المتخمرة، أو العلاجات المشتقة من الميكروبيوم عبر أنواع متعددة من السرطانات.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال تقليل النتائج الإيجابية الكاذبة الناتجة عن النماذج ثنائية الأبعاد (2D) ورصد التأثيرات المعتمدة على البيئة الدقيقة.
- القيمة التشغيلية: توحد سير عمل توليد الكريات الخلوية (Spheroids) ومعالجتها، مما يحسن قابلية التكرار عبر المواقع المختلفة ويقلل من تباين المقايسات.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن كفاءة رأس المال من خلال تمكين التخفيف المبكر من مخاطر التدخلات التي تستهدف الميكروبيوم قبل إجراء الدراسات المكلفة داخل الكائن الحي (in vivo).
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر للمركبات الرائدة من المنتجات الطبيعية بناءً على تحفيز الموت الخلوي المبرمج (Apoptosis) والاستجابة للجرعة في النماذج ذات الصلة سريرياً.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في زراعة البكتيريا اللاهوائية، والتعامل مع الكريات ثلاثية الأبعاد (3D spheroid)، وتقنيات مقايسة الموت الخلوي المبرمج (qPCR، WB، FACS).
- يعتمد على أجهزة تشمل غرف اللاهوائية، والحاضنات الهزازة، والمطياف الضوئي، وأجهزة قياس التدفق الخلوي.
- يستلزم توحيد المعايير بين فرق علم الأحياء الدقيقة وبيولوجيا السرطان لضمان اتساق تحضير LCFS ومراقبة جودة الكريات.
- يتضمن اعتبارات التكييف عند التوسع في استخدام سلالات بكتيرية أخرى أو أنواع سرطانية خارج نماذج سرطان القولون والمستقيم.
- يتقيد بهشاشة الكريات أثناء تبديل الوسط الغذائي، مما يتطلب تعاملاً رقيقاً للحفاظ على السلامة الهيكلية لضمان دقة القراءات.
الأسئلة الشائعة حول الصناعات الدوائية الحيوية
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
Bacterial Cell Culture and Lactobacillus Cell-Free Supernatant (LCFS) Preparation
2:18
Colorectal Cancer Cell Line Preparation
3:12
Spheroid Formation
3:49
3D colorectal Cancer Cell LCFS Treatment
4:26
Results: Representative Effects of LCFS Co-Culture on Spheroid Formation and Viability
5:22
Conclusion
