التركيز المسبق المستند إلى الورق وعزلة الميكروفيسلات واكسوسوم

في هذا البروتوكول، نحن وصف طريقة بسيطة لاختلاق جهاز الورقية يسمى لوحة XO، التي تم تصميمها لإثراء فعالة في عزلة من العويصلات خارج الخلية. لوحة XO هو جهاز بسيط يمكن أن قبل التركيز وعزل حويقد خارج الخلية دون استخدام أي مواد كيميائية أو آلات العمل، في حين تظهر معدلات استرداد أعلى من الطرق التقليدية. ابدأ بتعريف المنطقة التي سيتم طباعتها باستخدام برامج الطابعة.

يجب أن يكون التصميم 12 طبقة منقوشة بالشمع حيث تضيق أقطار مناطق العينة الدائرية تدريجياً من خمسة إلى ملليمترين. ثم، طباعة الشمع الهدّاب على المناطق المعينة على جانبي ورقة السليلوز. ضع الشمع المطبوع في فرن المختبر لمدة 80 ثانية عند درجة حرارة 120 درجة مئوية، ثم اقطع ورق الشمع المطبوع مع قاطع لصنع أجهزة XO Pad الفردية.

إسقاط خمسة واثنين microliters من غشاء بيرم انتقائية على مناطق العينة في معظم اليسار ومعظم الطبقات اليمنى، على التوالي. ضع الطبقات المرمزة مع الغشاء الانتقائي بيرم على لوحة ساخنة في 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتتبخر المذيبات. ثم ختم السطح الخارجي للطبقة المطلية التي تواجه الحل العازلة مع الشريط الحساس للضغط، وترك ثقب صغير.

قم بطي جهاز XO Pad ذهاباً وإياباً على طول الخطوط البيضاء لتوصيل كافة مناطق العينة بشكل متقارب. Pipette 15 ميكرولترات من العينة الدقيقة وicsوم في مناطق العينة متقاربة والانتظار بضع ثوان لضمان التبول الكامل. ضع غرفتين من الاكريليك على طرفي لوحة XO واربطها بشكل آمن مع مقاطع صغيرة لمنع تتكشف.

ملء الغرف مع 110 ميكروليتر من 0.1X PBS وإدراج اثنين من الأقطاب الفضية. ثم استخدام التيار الجهد مصدر قياس النظام لتطبيق 30 فولت على الأقطاب الكهربائية لمدة 20 دقيقة. لعزل الميكروبات المخصبة واكسوسومات، فصل لوحة XO مطوية من غرف الاكريليك وتتكشف الجهاز لعزل الجسيمات المخصب من الطبقات الأخرى.

لكمة من مناطق العينة في الطبقات الثامنة والتاسعة حيث يتم إثراء microvesicles وicsومes لتحليل المصب. تم إجراء فحص هجرة الفاصل الزمني للجسيمات الدقيقة واكسوسوس ذات التسمية الفلورية من أجل تحسين وقت التشغيل لأقصى قدر من استعادة الجسيمات المخصبة. تم تحديد كثافة الفلوريسين في جميع مناطق العينة مع برنامج ImageJ.

قبل عملية التخصيب، كانت جسيمات الدقيق و الكوسومات تتناثر في جميع مناطق العينة مع انخفاض تدريجي في الكثافة. بعد 10 دقائق من المعالجة، هاجرت الجسيمات كهربائيا الحركية وظهر قابس ما قبل التركيز الفوري على الطبقة السابعة. عندما بلغ الوقت 20 دقيقة، كانت تركز بقوة microvesicles و exosomes على الطبقات ثمانية وتسعة وإثراء خمس أضعاف على أساس شدة الفلوريسين.

وتم التحقيق في سلامة الجسيمات الدقيقة المخصبة واكسوسوم في الطبقة الثامنة مع وزارة الصغر الصغر، ولوحظت أكثر بكثير من الجسيمات غير التالفة بعد عملية التخصيب. كما تم تحليل حجم توزيع الميكروفيسات المخصبة والاكوسومات.

وفي وقت لاحق، تم تحليل التركيز الفعلي للميكروفيسلات الدقيقة المخصبة واكسوسوم على مناطق العينة في الطبقات السادسة والثامنة و10. في الطبقة الثامنة، كانت الميكروسات الدقيقة والإكسوسومات مركزة مسبقاً بمعامل 5.58، ولكن لم يلاحظ تركيز مسبق ملحوظ في الطبقات الأخرى. لضمان إعادة إنتاج هذا الإجراء، اتبع بدقة البروتوكول لوقت حضانة الفرن ودرجة الحرارة أثناء التحقق من الجهاز ووقت تشغيل الجهاز لأن تلك هي الظروف المثلى.

كما يمكن استخدام وسادة XO لفصل وعزل حويصلات خارج الخلية عن العينات الغنية بالبروتين، مثل المصل أو البلازما، باستخدام عازلة الكربونات. يمكن لهذا البروتوكول أن يوفر أداة إعداد فعالة وبسيطة، مع قدراته السابقة التركيز والعزلة اللازمة للبحوث السريرية، مثل التشخيص، وتسليم الأدوية، والعلاج المناعي، وغيرها من العلاجات.