التصوير داخل النواة أكتين رودز في الحرارة الحية وشدد الأجنة Drosophila

بروتوكولنا مهم لأنه يستخدم تقنية الحقن المجهري الراسخة في ذبابة الفاكهة للسماح بإجراء بحث جديد حول استجابة إجهاد الأكتين وتجميع قضيب الأكتين المصاحب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا دراسة استجابة إجهاد الأكتين في ظل مجموعة متنوعة من السياقات ، مثل شاشة متحولة أو في ظل ظروف إجهاد مختلفة. قد يعاني الفرد الذي لم يقم بهذه التقنية من قبل في التعامل مع الأجنة وإجراء الحقن المجهري.

نوصي بممارسة هذه الخطوات حتى يشعر المستخدم بالراحة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن خطوات التعامل مع الأجنة وتحديد موضعها وتركيبها لكل من الحقن المجهري والتصوير قد لا تكون واضحة من التعليمات المكتوبة وحدها. تحضير أكواب جمع الأجنة وأطباق أجار عصير التفاح وفقا لتوجيهات المخطوطة.

لتعزيز وضع البيض الأكثر سخاء ، قم بإعداد أكواب التجميع مع الذباب قبل يومين من التجربة. أضف ما لا يقل عن 100 ذبابة و 50 ذكرا إلى كل كوب تجميع ، ثم قم بتغطيته بطبق عصير تفاح. قم بإعداد محلول عملي من G-actin red وقم بتخزينه على الثلج حتى يتم تحميله في الإبرة الدقيقة.

اسمح للذباب بوضع الأجنة لمدة 30 دقيقة على أطباق عصير التفاح مع معجون الخميرة عند 18 درجة مئوية. أثناء وضع الذباب ، اقطع إسفينا مستطيلا بحجم أربعة سنتيمترات في واحد من أجار عصير التفاح بشفرة حلاقة وضعه على شريحة زجاجية مقاس 25 × 75 ملم. احصد الطبق من المجموعة وقم بإزالة الأجنة عن طريق سكب محلول التبييض الطازج على الطبق وتدويره لمدة دقيقة واحدة.

بلل شعيرات فرشاة الرسم بالماء المقطر ، ثم استخدمها لنقل الأجنة المفككة والمغسولة من سلة التجميع إلى إسفين أجار عصير التفاح المحضر على الشريحة الزجاجية. استخدم زوجا من الملقط ذو الأطراف الدقيقة أو إبرة تشريح لترتيب 10 أجنة في خط مستقيم على طول المحور الطويل لإسفين أجار المستطيل. رتب الأجنة من الرأس إلى الذيل بحيث يكون جانبها الظهري مواجها للباحث.

اقطع نصف سنتيمتر من نهاية طرف ماصة P200 بشفرة حلاقة واغمسها في غراء الجنين. قم بتغطية منطقة من خمسة ملليمترات بسخاء على طول الحافة الطويلة لغطاء مستطيل مقاس 24 × 50 ملم واتركه يجف بحيث يجف جانب الغراء لأعلى. بمجرد أن يجف غراء الجنين ، ضع جانب غراء الغطاء برفق لأسفل أعلى صف الأجنة المحاذاة على الأجار ، مع ترك مسافة من ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات بين حافة الغطاء وصف الأجنة.

اقلب الغطاء بحيث تكون الأجنة متجهة لأعلى. يجب أن تكون عالقة في خط على طول حافة طويلة من الغطاء مع مواجهة المنطقة البطنية لأقرب حافة. ضع الغطاء فوق 150 جراما من المجفف الأزرق الطازج في وعاء علوي لولبي سعة 16 أونصة وقم بلفه بإحكام على الغطاء.

جفف الأجنة لمدة 8 إلى 10 دقائق ، ثم قم بإزالة الغطاء من البرطمان المجفف وقم بلصق كل جانب قصير من الغطاء على جانب الجنين لأعلى بالمجهر. أضف قطرتين إلى ثلاث قطرات من زيت الكربون المجوف 27 مع ماصة باستور لتغطية الأجنة المحاذاة وحمايتها من المزيد من الجفاف. أثناء تجفيف الأجنة ، قم بتحميل المادة الطافية الحمراء G-actin المعدة مسبقا في الإبرة الدقيقة بطرف محمل دقيق.

قم بتوصيل الإبرة الدقيقة بحامل الإبرة وشد المسمار. ضع الشريحة مع الأجنة المثبتة على مرحلة المجهر واستخدم أدوات التحكم في الإبرة الدقيقة لإحضار الإبرة إلى نفس المستوى البؤري مثل الأجنة. أدخل الإبرة الدقيقة في الجنين بحيث تصطدم بالجنين في منتصف المنطقة البطنية عند خط الاستواء الجنيني.

عندما يكون طرف الإبرة الدقيقة مرئيا داخل منتصف الجنين، قم بتشغيل الحقن. بعد الحقن ، قم بإزالة الإبرة الدقيقة ببطء. حرك المسرح وقم بإجراء الحقن على الأجنة الأخرى.

بعد حقن جميع الأجنة ، ضع الشريحة مع الأجنة في غرفة حضانة رطبة وأغلق الغطاء. قم بإزالة الشريحة مع الأجنة المحقونة من غرفة الحضانة الرطبة. العمل بسرعة ، انزع قطع الشريط على الوجهين التي تم استخدامها للصق الغطاء بالشريحة.

قم بلصق قطعتين بطول 2.5 سم من الشريط على الوجهين معا وقم بقص الشريط من المنتصف بالطول لعمل شريطين. قم بلصق 2/3 من طول كل شريط شريط على الغطاء الأول ، مع إفراغ كل جانب من الأجنة. اترك 1/3 من شرائط الشريط معلقة من حافة الغطاء الأول حيث تكون الأجنة عالقة.

ضع برفق غطاء مستطيل ثان فوق شرائط الشريط لشطيرة الأجنة بين الغطاءات ، مع محاذاة الحواف 25 ملم مع الحفاظ على حواف 50 ملم موازنة عن بعضها البعض بمقدار سنتيمتر واحد. تأكد من أن مرحلة التسخين في درجة الحرارة المناسبة. وإذا كنت تستخدم مجهرا مقلوبا ، فأضف سائل الغمر إلى العدسة الشيئية المحددة.

ضع شطيرة الغطاء على المسرح بعناية ، وتأكد من أن سطح التصوير الجديد هو الذي يلامس سائل الغمر. ركز على الجنين الموجود في الخلية ، ثم قم بالتبديل إلى وضع اكتساب الليزر على المجهر متحد البؤر واضبط طاقة الليزر والكسب وحجم الإطار والتبليط وإعدادات الإسقاط حسب الرغبة. التقط صورا للعرض السطحي من خلال المستويات البؤرية لنوى الجنين للعثور على قضبان الأكتين داخل النواة.

يجب أن تظهر القضبان في اتجاهات متعددة كخطوط أو نقاط ساطعة داخل النوى المظلمة نسبيا. تتجلى استجابة إجهاد الأكتين والأجنة المجهدة بالحرارة من خلال تجميع قضبان الأكتين داخل النواة. تظهر قضبان الأكتين في اتجاهات مختلفة داخل النوى ويمكن تصويرها من خلال عدة مستويات بؤرية.

بالمقارنة ، فإن أجنة التحكم المحتضنة عند 18 درجة مئوية لا تعرض قضبان الأكتين. يمكن قياس النسبة المئوية للنوى المحتوية على قضبان ويمكن إجراء تجارب FRAP على القضبان. يظهر هنا مثال على مخطط استرداد التألق لمنطقة مبيضة مقابل غير مبيضة من قضيب الأكتين.

عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تكوين قضيب الأكتين يعتمد على درجة الحرارة. بالنسبة للخطوات التي تلي الحقن المجهري ، من الضروري الحفاظ على الأجنة في درجة حرارة الحضانة المطلوبة. بعد الحقن المجهري ، يمكن للباحث إجراء FRAP لتأكيد عدم وجود دوران F-actin في قضبان الأكتين أو لتحديد التغيرات في دوران F-actin التي تحدث في الهياكل الأخرى الغنية بالأكتين.