غشاء الخلية الأصلية نظام الجسيمات النانوية لتحليل التفاعل البروتينية الغشاء
يوليو 16, 2020
هنا هو بروتوكول لتحديد الدولة القلة من البروتينات الغشاء الذي يستخدم نظام غشاء الخلايا الأصلية نانو جسيمات بالاقتران مع المجهر الإلكتروني.
سيساعد هذا البروتوكول الباحثين على تحديد الحالة القلة الأصلية لبروتينات الغشاء بشكل أكثر دقة من خلال استخدام نظام الجسيمات النانوية لغشاء الخلية الأصلي جنبا إلى جنب مع المجهر الإلكتروني. تتمثل ميزة هذه التقنية في أنها توفر بيانات هيكلية دقيقة لبروتينات الغشاء في بيئة شبيهة بغشاء الخلية الأصلية ، ويمكن استخدامها لتحديد الهيكل عالي الدقة في المستقبل. سيوضح الإجراء كايل كروك ، زميل ما بعد الدكتوراه من مختبري.
لتحضير الجسيمات النانوية لغشاء الخلية الأصلية ، قم بإعادة تعليق جرام واحد من حبيبات الغشاء ذات الأهمية في 10 ملليلتر من NCMN Buffer A.استخدم الخالط الزجاجي Dounce لتجانس عينة غشاء الخلية المعلق عند 20 درجة مئوية ونقل العينة المعلقة إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 50 مل. أضف محلول مخزون البوليمر النشط الغشائي و NCMN Buffer A الإضافي إلى العينة إلى التركيز النهائي للبوليمر النشط الغشائي بنسبة 2.5٪ ورج المحلول لمدة ساعتين عند 20 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، الطرد المركزي الفائق العينة.
أثناء الطرد المركزي ، قم بموازنة عمود NTA سعة خمسة ملليلتر من النيكل مع 25 مل من NCMN Buffer A.At نهاية الطرد المركزي ، وانقل المادة الطافية إلى العمود واستخدم مضخة حقنة مضبوطة على معدل تدفق 0.5 ملليلتر في الدقيقة لتحميل المادة الطافية على العمود عند 20 درجة مئوية. اغسل خطوط آلة الكروماتوغرافيا السائلة للبروتين السريع باستخدام ما يكفي من NCMN Buffer B لشطف النظام بالكامل وتوصيل العمود بآلة الكروماتوغرافيا. اغسل العمود ب 30 مل من NCMN Buffer B بمعدل تدفق واحد مليلتر في الدقيقة واجمع التدفق.
اغسل العمود ب 30 مل من NCMN Buffer C بمعدل تدفق واحد مليلتر في الدقيقة واجمع التدفق. قم بتخفيض البروتين ب 20 مل من NCMN Buffer D بمعدل تدفق 0.5 مليلتر في الدقيقة واستخدم مجمع الكسر لجمع أجزاء مليلتر واحد من العينة ، ثم قم بتخزين عينات البروتين عند أربع درجات مئوية باستخدام SDS-PAGE للتحقق من العينات التي تتوافق مع القمم التي لوحظت على الرسم البياني لشطف الكروماتوغرافيا السائلة للبروتين السريع. لتحضير شبكات البقع السلبية ، لف شريحة زجاجية بورق ترشيح بحيث يكون جانب الكربون متجها لأعلى وضع الشبكات التي سيتم استخدامها لتحضير العينة على الشريحة.
ضع الشريحة الزجاجية مع شبكات المجهر الإلكتروني في حجرة مفرغ التوهج بين القطبين واستبدل الغطاء الزجاجي مع التأكد من أن الغطاء في المنتصف ومحكم الغلق. قم بتشغيل آلة تفريغ التوهج وتأكد من أن الضوء الأرجواني الناتج عن البلازما مرئي. عند الانتهاء من تشغيل الماكينة ، انتظر حتى تصل الغرفة إلى الضغط الجوي قبل إزالة الغطاء الزجاجي ووضع الشريحة على المقعد.
اضبط تركيز عينات البروتين المنقى إلى حوالي 0.1 ملليغرام لكل مليلتر وقم بتحميل 3.5 ميكرولتر من عينة البروتين على شبكة الكربون بسماكة 10 نانومتر. بعد دقيقة واحدة ، استخدم قطعة من ورق الترشيح لإزالة السائل من سطح شبكة المجهر الإلكتروني وغسل سطح الشبكة ثلاث مرات بقطرة واحدة من الماء سعة ثلاثة ميكرولتر لكل غسلة. بعد آخر غسيل بالماء ، اغسل سطح الشبكة مرتين أخريين بثلاث قطرات ميكرولتر من أسيتات اليورانيوم الطازجة المفلترة بنسبة 2٪ لكل غسلة.
بعد آخر غسل لأسيتات اليورانيوم ، قم بتلطيخ الشبكة بقطرة ثلاثة ميكرولتر من أسيتات اليورانيوم الطازجة المفلترة بنسبة 2٪ لمدة دقيقة واحدة. في نهاية الحضانة ، استخدم قطعة جديدة من ورق الترشيح لإزالة القطرة وتجفيف الشبكة بالهواء لمدة دقيقة واحدة على الأقل قبل تخزين الشبكة في صندوق شبكي لاستخدامها لاحقا. هنا ، يمكن ملاحظة صور البقع السلبية التي تم الحصول عليها باستخدام المجهر الإلكتروني المنقول كما هو موضح.
تكشف صورة البقع السلبية لعينة بروتين قناة مقاومة الأكرافلافين B من النوع البري المنقاة بالمنظفات عن محلول متجانس من الجسيمات أحادية التشتت مع عرض البروتين بنية رباعية ثلاثية محددة جيدا. تتوافق هذه الهياكل الثلاثية مع مخطط الكروماتوغرام لاستبعاد الحجم المرصود بعد التنقية. بالمقارنة ، في صورة البقعة السلبية لمتحور P223G المنقى أيضا بالمنظف ، يوجد محلول غير متجانس من الجسيمات النانوية متعددة التشتت مع ميل نحو التجميع ولكن لا يمكن ملاحظة أدوات تشذيب أصلية يمكن ملاحظتها.
هذه النتائج مدعومة أيضا بكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. لوحظت نتائج مماثلة للبروتينات البرية والطافرة بعد التنقية باستخدام NCMNP11 البوليمر النشط الغشائي يسهل استخدام البوليمر NCMNP52 توليد الجسيمات النانوية لغشاء الخلية الأصلية بأحجام أكبر بكثير مما يسمح بتصوير العديد من بروتين قناة مقاومة الأكرافلافين B في جسيم غشاء خلية أصلي واحد.
ومع ذلك ، في العينة الطافرة ، لم يتم ملاحظة أي جزيئات تشذيب ، حتى عند النظر إلى بقع غشاء الخلية الأصلية الكبيرة ثنائية الطبقة. يؤكد تحليل SDS-PAGE لعينات البروتين المنقى وجود مقاومة الأكرافلافين B في جميع العينات ذات النقاء الأكبر من 95٪ عند الوزن الجزيئي المتوقع للبروتين. عند تعديل هذا البروتوكول للبروتينات الأخرى ، من المهم تحديد الكمية المناسبة من جزء الغشاء تجريبيا والطول والوقت ودرجة الحرارة لعملية الذوبان.
إذا كشفت صور العينة عن محلول متجانس من الجسيمات أحادية التشتت بوحدات هيكلية محددة جيدا ، فيمكن استخدام العينة لتحديد الهيكل عالي الدقة باستخدام المجهر الإلكتروني بالتبريد.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
سيساعد هذا البروتوكول الباحثين على تحديد الحالة الأوليغوميرية الطبيعية للبروتينات الغشائية بدقة أكبر من خلال استخدام نظام الجسيمات النانوية لغشاء الخلية الطبيعي بالاقتران مع الميكروسكوب الإلكتروني. توفر هذه التقنية بيانات هيكلية دقيقة للبروتينات الغشائية في بيئة تشبه غشاء الخلية الطبيعي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الكيمياء الحيوية
- البيولوجيا الهيكلية
الخلفية
- فهم الحالة الأوليغوميرية للبروتينات الغشائية أمر بالغ الأهمية لتوضيح وظيفتها.
- قد لا تعكس الطرق التقليدية البيئة الطبيعية لهذه البروتينات بدقة.
- يوفر الميكروسكوب الإلكتروني قدرات تصوير عالية الدقة.
- توفر الجسيمات النانوية لغشاء الخلية الطبيعي سياقًا أكثر واقعية لدراسة البروتينات الغشائية.
غرض الدراسة
- تطوير بروتوكول موثوق لتحديد الحالة الأوليغوميرية للبروتينات الغشائية.
- استخدام الجسيمات النانوية لغشاء الخلية الطبيعي لتحليل الهيكل.
- تعزيز دقة البيانات الهيكلية التي تم الحصول عليها من البروتينات الغشائية.
الطرق المستخدمة
- تحضير الجسيمات النانوية لغشاء الخلية الطبيعي من كريات الغشاء.
- تجانيس عينات غشاء الخلية باستخدام جهاز تجانس زجاجي Dounce.
- الطرد المركزي الفائق لعزل الجسيمات النانوية.
- الميكروسكوب الإلكتروني لتصور هياكل البروتينات الغشائية.
النتائج الرئيسية
- تحضير ناجح للجسيمات النانوية لغشاء الخلية الطبيعي.
- تحديد دقيق للحالات الأوليغوميرية للبروتينات الغشائية.
- صور عالية الدقة تم الحصول عليها عبر الميكروسكوب الإلكتروني.
- إمكانية تحديد الهيكل عالي الدقة في المستقبل.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول طريقة قوية لدراسة البروتينات الغشائية.
- استخدام بيئة طبيعية يعزز دقة البيانات الهيكلية.
- قد تشمل التطبيقات المستقبلية التحليل الهيكلي التفصيلي لمختلف البروتينات الغشائية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Accurate determination of membrane protein oligomeric states is critical for target validation in drug discovery, as misinterpretation can lead to failed mechanistic hypotheses. The native cell membrane nanoparticle system preserves native lipid bilayer context, reducing artefactual dissociation or denaturation seen in detergent-based methods. This enables more reliable structural data for de-risking early-stage targets and informing lead identification strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by resolving native oligomeric states of membrane protein targets like AcrB.
- Operational Value: Provides structural clarity in a native-like environment, reducing false negatives in target validation assays.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by confirming functional quaternary structures prior to downstream investment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates stable, monodisperse nanoparticles suitable for reproducible biophysical assays.
- Operational Value: Enables standardization of membrane protein preparations across screening campaigns.
- Scalability: Facilitates preparation of large bilayer patches for imaging multiple protein complexes per particle.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-stage structural insights with preclinical validation by maintaining native membrane context.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from native oligomeric states rather than detergent-induced artifacts.
- Biomarker Alignment: Supports target engagement studies where oligomeric state correlates with functional output.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing structural inputs that inform hit-to-lead progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing native quaternary arrangements of membrane protein complexes.
- Screening: Delivers assay-ready, homogeneous protein nanoparticles for consistent compound screening.
- Analytics: Enables quantitative assessment of oligomeric state via electron microscopy and size exclusion chromatography.
- Translational Research: Ensures structural findings are translatable to native physiology, improving predictive confidence.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for membrane protein structural analysis across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target mechanism by preserving native protein-lipid interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and reduces variability in structural data generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing biological uncertainty in early targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in membrane protein isolation and nanoparticle formation.
- Depends on access to ultracentrifugation, FPLC, and electron microscopy instrumentation.
- Necessitates standardization of buffer conditions and polymer concentrations across teams.
- Involves optimization of solubilization time, temperature, and membrane fraction for each target.
- Limited by the need for empirical determination of solubilization parameters per membrane source.
