أتمتة قياسات المجهر القوة الحيوية الذرية على مئات من خلايا ألبيكانس C.

أتمتة المجهر القوة الذرية هو الابتكار الرئيسي في تطور التكنولوجيا نحو التطبيقات الطبية الحيوية. كما أنه يفتح المجال للتحقيق في الخصائص الميكانيكية الحيوية لتجمعات الخلايا. طريقتنا تجعل من الممكن تسجيل قياسات AFM ل1000 خلية في أربع ساعات ، مقارنة بالطرق المعتادة ، والتي تستغرق أربع ساعات لقياس 10 خلايا ، وهذا هو في الحقيقة مكسب كبير من الوقت.

إذا كانت الأتمتة شرطا أساسيا لجلب هذه التكنولوجيا إلى مختبرات المستشفيات ، فإن بروتوكول إثبات المفهوم هذا يشير إلى إمكانية استخدامها في تطوير استراتيجيات تشخيص طبية محددة. يستخدم هذا البروتوكول جذع PDMS متعدد الاستخدامات يمكن ملؤه بمختلف الميكروبات مما يسمح باستكشاف أنظمة مختلفة. لإعداد ختم PDMS، مزيج 55 غراما من PDMS حل ما قبل البوليمر في نسبة كتلة 10 إلى واحد في PDMs، oligomers، وعامل علاج وdgas الحل الناتج تحت فراغ في مرة واحدة 10 إلى واحد إلى واحد سلبي مرات 10 إلى القضبان السلبية اثنين لمدة خمس إلى 10 دقائق.

عندما تمت إزالة جميع فقاعات الفخاخ ، صب 20 غراما من محلول degassed على قالب السيليكون الرئيسي إلى سمك 2-3 ملليمترات وديغا مرة أخرى. عندما تتم إزالة جميع الفقاعات ، قم بإعادة صياغة PDMS عند 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة واستخدم مشرطا لقطع الطابع الهيكلي الدقيق PDMS بالتوازي مع صفائف البنية الدقيقة المرئية. ثم قشر الطابع من قالب السيليكون الرئيسي ووضع موقع هيكل الطابع الجزئي حتى على شريحة زجاجية مع الهياكل الصغيرة الانحياز مع جانب الشريحة.

لإعداد الخلايا للجهاز، والطرد المركزي 600 ميكرولتر من تعليق الخلية من الفائدة وإضافة 200 ميكرولتر من supernatant على الطابع. ديغا العملاق تحت فراغ لمدة 40 دقيقة. عندما تتم إزالة جميع الفقاعات ، استبدل الناموست من سطح PDMS ب 200 ميكرولتر من محلول الخلية الذي أعيد إنفاقه لاحتضانه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

لتحميل الخلايا في الهياكل الدقيقة للطابع، استخدم شريحة زجاجية تم الاحتفاظ بها بزاوية 30 إلى 50 درجة لنشر الخلايا عبر الطابع في كلا الاتجاهين، عدة مرات حسب الضرورة. عندما يتم تحقيق معدل تعبئة عالية من microstructures، استخدم ماصة لإزالة تعليق الخلية وغسل ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من العازلة خلات لكل غسل لإزالة أي خلايا غير منقوبة. بعد الغسيل الأخير، استخدم تدفق النيتروجين لتجفيف الجزء الخلفي من العينة ووضع الطابع في طبق بيتري.

ثم أضف اثنين من ملليلتر من العازلة خلات الطازجة إلى الطبق. بالنسبة للفحص المجهري للقوة الذرية للخلايا ، ضع الطبق على مرحلة مجهر القوة الذرية ومركز المسرح عند الصفر إلى الصفر. عندما تركزت المرحلة، نقل الطبق إلى حامل طبق بيتري المجهر ومحاذاة حافة الطابع بحيث يكون عموديا على المحور ص من حامل طبق بيتري.

ثم ضع قوة المجهر الذري على خشبة المسرح ، مع الحرص على أن يتم تمديد محركات السائر بما فيه الكفاية لتجنب تحطم الطرف على الطابع. للتصوير، استخدم مقابض المجهر لمركز طرف مجهر القوة الذرية فوق الزاوية اليسرى من آبار العدادات الصغيرة 4.5 في 4.5 متر مربع وحدد وضع رسم خرائط القوة في برنامج المجهر. لتعيين خريطة قوة 64 في 64 على مساحة 100 في 100 ميكرومتر ، تعيين نقطة المجموعة النسبية إلى ثلاثة إلى خمسة نانو نيوتن ، وطول Z إلى أربعة ميكرومترات ، وحركة Z إلى مدة ثابتة ، ووقت التمديد إلى 0.01 ثانية ، وتأخير التمديد إلى الصفر ، وتأخير التراجع إلى الصفر ، ووضع التأخير للقوة الثابتة ، معدل العينة إلى 2048 Hertz.

قم بإلغاء تحديد حلقة Z المغلقة وتحقق من الصورة المربعة. تعيين الوصول السريع إلى 100 ميكرومتر، المحور البطيء إلى 100 ميكرومتر، X الإزاحة إلى صفر ميكرومتر، إزاحة Y إلى صفر ميكرومتر، زاوية الشبكة إلى صفر درجة، بكسل إلى 64 في 64، ونسبة بكسل إلى واحد إلى واحد. فتح المقبل برنامج التشغيل الآلي.

في الإطار المنبثق، حدد المسار نحو ملف البرنامج النصي. أدخل تنسيق W1 في سطر المتغير P1 239 من المقطع مربع المدخلات من البرنامج النصي gyfon و W2 تنسيق القيمة في P2 متغير سطر 241. سم قيمة الملعب إلى خط متغير الملعب 245 من السيناريو وإدخال البعد جيدا، والتي يمكن تحديدها من تصميم أنماط البئر في خط متغير W-S 248.

اكتب المسار إلى دليل الحفظ في السطر 251 لحفظ البيانات في المكان المطلوب وتعيين إجمالي خط متغير المنطقة 254 إلى الرغبة في نهاية متعددة من 100 ميكرومتر. ثم تعيين قوة منحنيات مصفوفة الصف والعمود المسجلة في بئر في عدد بمسح متغير خط 257 وانقر فوق تشغيل لبدء البرنامج. لتحليل البيانات، استخدم برنامج التعليمات البرمجية استوديو الفيديو لفتح البرنامج النصي بيثون وتنفيذ نسخ الملفات بيثون البرنامج النصي لتنظيم ملفات منحنى القوة في مجلد واحد.

إدخال المسار إلى المجلد العام حيث سيتم تخزين البيانات. لتحليل منحنيات القوة ، وفتح القوة الذرية المجهر مصنع البيانات معالجة البرمجيات. في قائمة الملفات، حدد مجموعة من منحنيات التحليل الطيفي.

حدد التالي ملف وتحميل العملية، وحدد عملية صلابة. حدد الخطوة الأخيرة من العملية وانقر فوق الاحتفاظ وتطبيقها على الجميع بحيث تتلقى جميع منحنيات القوة نفس المعاملة. لفتح البرنامج النصي R، قم بتحميل الملفات التي تحتوي على المعلومات المستخرجة باستخدام برنامج معالجة البيانات في برنامج استوديو R.

في إطار البيئة، انقر فوق استيراد مجموعة البيانات ومن قارئ النص في الإطار المنبثق، انقر فوق استعراض لتحديد موقع الملف TSV نقطة. بمجرد تحميل الملف حدد منطقة تشغيل التعليمات البرمجية وتشغيل كافة لتشغيل كافة التعليمات البرمجية. هنا، تظهر مخططات نموذجية تم الحصول عليها باستخدام البروتوكول كما هو موضح.

في هذا التحليل، تم تسجيل إعادة تقسيم صلابة على 957 الخلايا الأصلية، بينما في هذا التحليل، تم قياس صلابة 574 خلية معالجة كاسبوفينجين. اعلم أن استخدام مئات الخلايا يسمح بتوزيع ثنائي الوسائط للقيم التي يجب ملاحظتها. وفي العينات الأصغر حجما، يلاحظ عادة توزيع واحد ويمكن أن يؤدي إلى عدم رصد عدم التجانس السكاني.

مقارنة بين الشرطين يسلط الضوء على آثار كاسبوفينجين على الحد من تصلب الخلية. وكشفت مقارنة ANOVA من الخلايا الأصلية والعلاجية، والظروف اثنين تظهر صلابة عالية، مختلفة بشكل كبير. تم الوصول إلى هذه القيمة بسبب العدد الكبير من الخلايا التي تم تحليلها ، مما يوفر ثقة أكبر في النتائج التي تم الحصول عليها.

إضافة supernatant إلى ختم PDMS قبل مسح الخلايا مرارا وتكرارا في الآبار حتى ختم كامل، أمر بالغ الأهمية لنجاح التحليل. في هذا الدليل على المفهوم ، تم تحليل خلايا المبيضات البيكان ولكن يمكن تطبيق البروتوكول على أي مجموعة من الخلايا النمطية أو الجزيئات أو المواد.