القياس الكمي لمدون المغذيات الكبيرة في شاشة عصبية حرارية جينية باستخدام يرقات دروسوفيلا

يتيح بروتوكولنا تحديد مجموعات الخلايا العصبية اليرقية التي تشفر الخيارات الغذائية المتعلقة بالتحكم في مستويات تناول اثنين من المغذيات الكبيرة الرئيسية ، البروتينات والكربوهيدرات. تسمح البساطة والإنتاجية العالية نسبيا لطريقتنا بتحديد كمية تناول الطعام للعديد من الأنماط الجينية المعرضة لظروف غذائية مختلفة. لعبور الخطوط الأبوية وراثيا ، قم بإعداد أقفاص لجمع الأجنة بحجم 60 ملم مع أطباق حمية تربية L3 مكملة ببعض معجون الخميرة النشط.

انقل العذارى البالغات TripA1 وذكور Janelia GAL4 الذين تتراوح أعمارهم بين خمسة إلى ثمانية أيام إلى أقفاص جمع الأجنة والسماح بالتزاوج لمدة 24 إلى 48 ساعة عند 25 درجة مئوية مع رطوبة 60٪ ودورة مظلمة فاتحة 12 ، 12. بعد فترة التزاوج ، انقل الذباب البالغ المتزاوج إلى أطباق حمية التربية الطازجة L3 واترك وضع البيض لمدة ثلاث إلى أربع ساعات عند 25 درجة مئوية. تأكد من أن جميع اللوحات مصنفة بالنمط الجيني وتاريخ وضع البيضة.

عند انتهاء فترة وضع البيض ، قم بإزالة الألواح من الأقفاص وتقدير عدد البيض لكل طبق عن طريق حساب عدد الأجنة في ربع اللوحة. حافظ على كثافة اليرقات بحد أقصى 200 جنين لكل طبق وقم بتغطية الألواح بأغطية بلاستيكية. احتضان ألواح التربية L3 عند 18 درجة مئوية ، ورطوبة 60٪ ، ودورة داكنة فاتحة 12 ، 12 لمدة تسعة أيام.

بعد الحضانة ، اجمع ثلاث مجموعات من 10 L3 من كل من الأنماط الجينية المراد اختبارها ، بالإضافة إلى مجموعة واحدة من 10 L3 للتحكم في الأغذية الصفرية. استخدم الملقط رقم خمسة أو وزن الريشة لجمع اليرقات بلطف قدر الإمكان. انقل اليرقات التي تم جمعها إلى قوارب بلاستيكية ذات وزن أطباق تحتوي على ملليلتر واحد من الماء.

قم بإعداد حاضنة 30 درجة مئوية وحافظ على مستويات الرطوبة عالية عن طريق إضافة صينية مملوءة بالماء لتجنب جفاف اليرقات أثناء الفحص. قم بموازنة درجة حرارة ألواح الفحص عن طريق تسخينها إلى 30 درجة مئوية قبل البدء. تأكد من أن جميع الأطباق مصنفة بالنمط الجيني ونسبة البروتين إلى الكربوهيدرات في النظام الغذائي.

حرارية لليرقات التجريبية لمدة دقيقتين عن طريق نقل القوارب البلاستيكية التي تحتوي على مباشرة إلى حمام مائي عند 37 درجة مئوية. اضبط العدد المطلوب من المؤقتات لمدة ساعة واحدة ، ثم قم بتصريف المياه بعناية من القوارب البلاستيكية وانقل مجموعات L3 من القوارب إلى وسط لوحات الأصول. قم بتغطية الأطباق وابدأ المؤقت.

اسمح لليرقات بالتغذي لمدة ساعة عند 30 درجة مئوية في الظلام. أوقف فحص التغذية عن طريق نقل الألواح إلى حمام جليدي. قم بإعداد أنبوبين دقيقين من المليلتر لكل مجموعة L3 تم اختبارها تحتوي على ما يكفي من حبات زجاجية 0.5 ملم لملء الجزء السفلي من الأنبوب الدقيق و 300 ميكرولتر من الميثانول المثلج.

استخدم مبرد مقاعد البدلاء للحفاظ على برودة الأنابيب الدقيقة. استرجع مجموعات L3 بعناية من لوحات فحص التغذية وانقلها إلى أغطية الألواح ببعض الماء. اشطف اليرقات لإزالة بقايا الطعام من أجسامها ، مع الحرص على تجنب أي إصابات.

انقل اليرقات إلى الأنابيب الدقيقة المحضرة وقم بتحللها باستخدام محلل الأنسجة لاستخراج صبغة الطعام من الأحشاء. انقل المستخلصات لتنظيف الأنابيب الدقيقة سعة 1.5 مليلتر عن طريق عكس الأنابيب الدقيقة المليلتر مباشرة على الأنابيب الجديدة. افعل ذلك برفق حتى تبقى معظم الخرزات الزجاجية في الجزء السفلي من أنبوب المليلتر.

قم بإزالة الحطام الخلوي عن طريق الطرد المركزي للمستخلصات بسرعة قصوى وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم انقل المواد الطافية لتنظيف أنابيب سعة 1.5 ملليلتر. لإجراء القياس الكمي للسعرات الحرارية لاستهلاك الغذاء ، قم بإعداد المحاليل القياسية للصبغة الزرقاء عن طريق تخفيفها بشكل متسلسل من واحد إلى اثنين في الميثانول. انقل 100 ميكرولتر من العينات التجريبية والمعايير والفارغة إلى آبار صفيحة دقيقة 96 بئر وقياس الامتصاص عند 600 نانومتر.

تم استخدام هذا البروتوكول لتحديد الكميات النسبية للمغذيات الكبيرة المستهلكة للحيوانات تحت التنشيط الوراثي الحراري لمجموعات عصبية معينة في الجهاز العصبي لليرقات. أثر تنشيط متميز لمجموعات الخلايا العصبية بشكل كبير على توازن المغذيات الكبيرة في يرقات الطور الثالث. يظهر نمط التغذية الذي لوحظ لخط التحكم ، المشار إليه هنا باللون الرمادي ، انخفاضا متوقعا في تناول الطعام في الأنظمة الغذائية ذات نسبة البروتين إلى الكربوهيدرات العالية ، مما يدل على فعالية الطريقة.

كانت الفئات الظاهرية الخمس التي تم إنشاؤها لحيوانات التجارب تأكل كثيرا وتعوض عن تخفيف البروتين عن طريق الإفراط في تناول الطعام ، وتناول الكثير من الطعام ، لكنها لا تعوض ، وتأكل القليل ، ولكنها تعوض ، وتأكل القليل ولا تعوض ، وتأكل بشكل شاذ. لكل من هذه الفئات والأنماط الجينية المظهرية ، يتم عرض أنماط GFP في الجهاز العصبي المركزي ليرقات الطور الثالث. عند محاولة هذا البروتوكول ، من المهم إنشاء يرقات مبكرة متزامنة من الناحية التنموية من أجل تقليل التباين المرتبط بسلوك.

باتباع هذا البروتوكول ، سيسمح وضع العلامات اللاسلكية على الأطعمة بتأكيد وتشريح المزيد من الضربات التي تم العثور عليها باستخدام هذه الطرق.