نموذج لتولد الصرع في رينال القشرة-قرن آمون ثقافات شريحة العضوية
مارس 18, 2021
هنا، ونحن نصف إعداد شرائح القشرة قرن آمون rhinal organotypic. في ظل الحرمان التدريجي والسيطرة عليها من المصل، وهذه الشرائح تصور الأحداث المتطورة مثل الصرع ويمكن اعتبار نموذج الجسم الحي السابق من تكوين الصرع. يمثل هذا النظام أداة ممتازة لرصد ديناميات النشاط التلقائي ، وكذلك لتقييم تطور الميزات العصبية خلال فترة تكوين الصرع.
الصرع هو مرض عصبي سائد. تصور شرائح الفص القشرة الحصين العضية Rhinal cortex-hippocampus الأحداث المتطورة الشبيهة بالصرع التي تشبه الصرع الحي ويمكن بالتالي استخدامها كنموذج حي سابق لتولد الصرع. هذا النظام هو في الواقع أداة ممتازة لرصد ديناميات وتطور الصرع ، وكذلك لفحص الأهداف العلاجية المحتملة لهذا المرض الدماغ.
إظهار الإجراءات معي سيكون طلابي فرانسيسكو ميدا ومافالدا كارفالو. لحصاد الدماغ من يوم ما بعد الولادة ستة إلى سبعة الجرو سبراغ دولي، غسل الرأس أولا ثلاث مرات في خمسة ملليلتر من GBSS. العمل في خزانة السلامة الحيوية، إدراج ملقط حاد بحزم في مآخذ العين لعقد الرأس في مكان واستخدام مقص تلميح رقيقة لقطع فروة الرأس على طول خط الوسط من الفوام الفقرية إلى الفصوص الأمامية.
قطع الجمجمة بنفس الطريقة وعلى طول الشق العرضي الدماغي واستخدام ملقط طويل منحني لتحريك قطع الجمجمة بعيدا. استخدام ملعقة لتجاهل المصابيح الشمية ونقل الجانب الظهري الدماغ تصل إلى لوحة 60 ملليمتر تحتوي على خمسة ملليلتر من GBSS الباردة. إدراج ملقط ناعم في المخيخ وإدراج ملعقة على طول خط الوسط لفتح نصف الكرة الأرضية بعناية.
استخدام ملقط منحني قصيرة لإزالة بعناية الأنسجة الزائدة التي تغطي قرن آمون دون لمس هيكل فرس النهر، ثم قطع تحت كل قرن آمون. نقل نصف الكرة الأرضية واحد في وقت قرن آمون الجانب صعودا وبالتوازي مع بعضها البعض على قطعة من ورق التصفية. ضع ورقة التصفية على مروحية نسيجية مع نصفي الكرة الأرضية عموديا على النصل وقطع نصفي الكرة الأرضية إلى شرائح 350 ميكرون.
نقل الأنسجة شرائح إلى طبق بيتري جديدة تحتوي على خمسة ملليلتر من GBSS الباردة واستخدام أقطاب طرف الجولة لفصل بعناية شرائح حفظ العينات فقط مع قشرة rhinal سليمة هيكليا وفرس النهر. وينبغي تحديد مناطق DG وCA بشكل مثالي وكذلك مناطق القشرة الأنف والهينية. استخدم ملعقة وقطبا كهربائيا مستديرا لوضع ما يصل إلى أربع شرائح سليمة على إدراج فردي في العدد المناسب من آبار لوحة سداسية البئر تحتوي على 1.1 ملليلتر من متوسط الثقافة لكل بئر.
استخدام ماصة P20 لإزالة أي وسيلة تشريح الزائدة من جميع أنحاء كل شريحة. ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية. تغيير المتوسطة كل يومين إلى ثلاثة أيام.
استخدم ملقط لرفع إدراج. يستنشق المتوسط من البئر المقابلة ووضع إدراج مرة أخرى في مكانها. استخدام ماصة P1000 لإضافة ملليلتر واحد من الطازجة 37 درجة مئوية المتوسطة إلى كل بئر.
إعداد إعداد الفيزيولوجيا الكهربية في دائرة مغلقة. تحقق من أن معدل تدفق غرفة نوع الواجهة يتم تعيينه إلى ملليلترين في الدقيقة وفتح صمام الكربوهيدرات الثور. تحقق من مستوى المياه في النظام ووضع قطعة من ورق التصفية في غرفة تسجيل واجهة لاستنزاف أي وسيلة الزائدة.
ضع قطعة من ورق تنظيف العدسة أسفل الإطار لتوفير وسيطة للشريحة ثم قم بتشغيل وحدة التحكم في درجة الحرارة ومكبرات الصوت والمتلاعبات الصغيرة. استخدم حقنة لتحميل قطب زجاجي بسائل النخاع الاصطناعي الطازج. ضع القطب الزجاجي في القطب المستقبل وانتظر استقرار درجة الحرارة في غرفة الواجهة عند 37 درجة مئوية.
العمل في خزانة السلامة البيولوجية، ضع إدراج في لوحة 60 ملليمتر مع قطرة من المتوسط. استخدام شفرة حادة لقطع شريحة من إدراج ووضع شريحة في غرفة واجهة مع قرن آمون إلى أسفل اليمين، ثم وضع القطب المتلقي في طبقة الخلية الهرمية CA3، والشروع في بروتوكول الاستحواذ المستمر، وتسجيل شريحة لمدة 30 دقيقة. لإجراء فحص امتصاص يوديد البروبيديوم، اعمل في خزانة السلامة الحيوية.
رفع إدراج من البئر وإضافة يوديد البروبيديوم في المتوسط إلى تركيز النهائي من اثنين من الميكروفونر لكل بئر. يهيج ببطء لوحة قبل وضع إدراج مرة أخرى في البئر، مع الحرص على أنه لا توجد فقاعات تحت شرائح. عندما يتم علاج جميع الشرائح، أعد الطبق إلى حاضنة ثقافة الخلية.
لاحتواء المناعة من شرائح, في نهاية حضانة يوديد البروبيديوم, يستنشق المتوسط من أسفل كل بئر وإضافة ملليلتر واحد من 4٪ paraformaldehyde إلى أعلى وأسفل كل إدراج. بعد ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، اغسل الشرائح مرتين لمدة 10 دقائق وميليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل غسل واستخدم قلما مسعورا لرسم مستطيلين على شرائح المجهر. استخدام شفرة حادة لقطع شرائح من إدراج ووضع شريحة واحدة في كل مستطيل.
أضف محلول حجب permeabilization إلى كل شريحة لاحتضان لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، أضف الأجسام المضادة الأولية ذات الأهمية إلى كل شريحة لاحتضان أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، اغسل الشرائح مع PBS-Tween ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل غسل واحتضان الشرائح بالأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك، اغسل الشرائح كما هو موضح وأضف 50 ميكرولتر من محلول Hoechst إلى كل شريحة لاحتضانها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد حضانة Hoechst ، اغسل الشرائح مرة أخرى وأضف 50 ميكرولتر من المتوسط المتصاعد إلى كل واحدة ، ثم ضع غطاء فوق الشرائح وختم مع طلاء الأظافر. بعد السماح للشرائح لتجف لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة، تصور امتصاص يوديد المناعة والبروبيديوم عن طريق المجهر confocal.
تصور شرائح الفص القشرة الحصين الوريدية العضوية النشاط المختلط بين الأسنان والهوتال في سبعة أيام في المختبر. وفي غضون 14 يوما في المختبر، يتسم النشاط العفوي بتصريفات تكنولوجيا المعلومات والاتصالات، التي تتطور إلى نشاط هائل في مجال تكنولوجيا المعلومات والاتصالات في المختبر لمدة 21 يوما مع أحداث ictal تستمر أكثر من دقيقة واحدة. الإقبال يوديد البروبيديوم والكيمياء المناعية ضد علامة الخلايا العصبية نيون كشفت بعض الموت العصبي في سبعة أيام في شرائح المختبر التي زادت بشكل كبير في 14 يوما في المختبر في جميع مناطق قرن آمون.
في سبعة أيام في المختبر، microglia ramified مع تعبير CD68 منخفضة هي أكثر وفرة من Iba1 CD68 إيجابية ميكروغليا التفاعلية الإيجابية. في حين أنه في 14 يوما في المختبر ، في جميع مناطق قرن آمون ، يتجاوز Iba1 الإيجابي CD68 amoeboid M1 microglia microglia مع تعبير CD68 منخفض. في 14 يوما في المختبر، يمكن تحديد بعض الخلايا الإيجابية CD68 إيجابية Iba1 مع ظهور فرط تشعبات، مما يشير إلى إمكانية النمط الظاهري M2 المضادة للالتهابات microglia.
في سبعة أيام في المختبر ، والتعبير عن CD3 بالكاد يمكن الكشف عنها ، في حين أنه في 14 يوما في شرائح المختبر ، يمكن ملاحظة فرط الرجفان الرجفي البروتين الحمضي إيجابية CD3 الخلايا الفلكية الإيجابية ، مما يشير إلى تفعيل التدريجي للخلايا الفلكية A1. إعداد شرائح قشرة قرن آمون rhinal بعناية فائقة. تأكد من إزالة الأنسجة الزائدة فوق قرن آمون لأنها يمكن أن تعرض للخطر سلامة شريحة أثناء تشريح.
وسوف يؤثر العجز البنيوي سلبا على قدرة الشرائح على البقاء. بالإضافة إلى النهج التي أظهرت، يمكن تطبيق عدد كبير من المقايسات مثل تحليل البقع الغربية، PCR في الوقت الحقيقي و ELISA على هذا النظام لمعالجة أسئلة محددة بشأن تكوين الصرع.
نظرة عامة
تستكشف هذه الدراسة إعداد الشرائح العضوية القشرية الشمية-الحُصين، والتي تعمل كنموذج خارج الجسم الحي لتكوين الصرع. تظهر هذه الشرائح أحداثًا تشبه الصرع تحت ظروف نقص المصل، مما يجعلها مناسبة لمراقبة النشاط التلقائي وتطور الالتهاب العصبي خلال عملية تكوين الصرع.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- تكوين الصرع
- الفيزيولوجيا الكهربية
الخلفية
- الصرع هو اضطراب عصبي شائع.
- توفر الشرائح العضوية نموذجًا يشبه إلى حد كبير الظروف الحية.
- يمكن تقييم تطور تكوين الصرع من خلال هذا النموذج.
- يمكن للعلماء استخدام النموذج لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة.
هدف الدراسة
- إعداد شرائح قشرية شمية-حصين عضوية.
- التحقيق في ديناميكيات النشاط الشبيه بالصرع.
- تقييم السمات الالتهابية العصبية خلال تكوين الصرع.
الطرق المستخدمة
- تم إعداد الشرائح العضوية للقشرة الشمية والحُصين من جراء سبراغ-داولي.
- تمت زراعة الشرائح ومراقبتها للبحث عن النشاط الشبيه بالصرع.
- تم إجراء تسجيلات فيزيولوجية كهربية لفحص النشاط التلقائي.
- استخدمت امتصاص يوديد البروبيديوم وعلم الأنسجة المناعي لتقييم سلامة الخلايا العصبية.
- تمت مراقبة التغيرات الديناميكية في النشاط على مدار ثلاثة أسابيع.
النتائج الرئيسية
- بعد سبعة أيام في المختبر، أظهرت الشرائح نشاطًا مختلطًا بين النوبات والشبيه بالنوبات.
- بحلول 14 يومًا في المختبر، تطور النشاط التلقائي مع زيادة تفريغ النوبات.
- في 21 يومًا في المختبر، استمرت أحداث النوبات السائدة لأكثر من دقيقة.
- تمت ملاحظة زيادة ملحوظة في موت الخلايا العصبية من سبعة إلى 14 يومًا في المختبر.
الاستنتاجات
- توفر هذه الدراسة نموذجًا موثوقًا لفهم تكوين الصرع والآليات المرتبطة به.
- قد تسهل النتائج استكشاف الأهداف العلاجية للصرع.
- تم تسليط الضوء على الرؤى في الآليات العصبية واللدونة خلال تكوين الصرع.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This model provides a reproducible ex vivo platform for studying epileptogenesis progression, enabling early-stage target validation and mechanistic de-risking in epilepsy drug discovery. By capturing evolving epileptic-like activity and neuroinflammatory changes over time, it supports predictive confidence in therapeutic screening and translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by modeling evolving epileptogenesis dynamics in a disease-relevant system.
- Operational Value: Supports functional target validation through longitudinal monitoring of epileptiform activity and neuronal death.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying compounds that modify epileptogenesis progression and neuroinflammatory markers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible system for preparing validated biological structures suitable for compound screening.
- Operational Value: Delivers quantitative electrophysiological and immunohistochemical readouts for reliable compound evaluation.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple time points and intervention studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models disease-relevant epileptogenesis progression with temporal dynamics mirroring in vivo pathology.
- Operational Value: Enables assessment of neuroinflammatory biomarkers and neuronal integrity changes over a three-week culture period.
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical validation by capturing key epileptogenesis hallmarks.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, offering a platform for mechanistic de-risking and predictive modeling in epilepsy research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by modeling epileptogenesis evolution in rhinal cortex-hippocampus circuits.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slice preparation and stable electrophysiological recording conditions.
- Analytics: Provides quantitative measurements of epileptiform activity, neuronal death (via propidium iodide), and glial activation for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling progressive epileptogenesis and neuroinflammation relevant to therapeutic intervention.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for longitudinal epileptogenesis studies across multiple compound screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by modeling epileptogenesis progression and reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability of epileptogenesis modeling across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of disease-modifying effects and reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through longitudinal assessment of antiepileptogenic potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organotypic slice culture, electrophysiology, and immunohistochemical techniques.
- Depends on specialized instrumentation including interface recording chambers, temperature controllers, and confocal microscopy systems.
- Necessitates cross-team standardization of slice preparation, culture maintenance, and assay timing for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending the model to other brain regions or neurological conditions.
- Practical limitations include the need for meticulous dissection to preserve hippocampal and rhinal cortex integrity during slicing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Rhinal Cortex-Hippocampus Slice Preparation
3:41
Electrophysiological Recordings
5:07
Propidium Iodide (PI) Uptake Assay and Immunohistochemistry
7:26
Results: Epileptic-like Events, Neuronal Death and Gliosis are Observed in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slices
9:18
Conclusion
