توصيف خصائص النقل داخل الغضاريف لحاملات الببتيد الموجب

ويتسم وصف خصائص نقل العلاجات وناقلاتها بأهمية حاسمة لضمان الاستجابات البيولوجية الفعالة. تساعد هذه الطرق في تصميم ناقلات المخدرات المشحونة على النحو الأمثل لاستهداف الأنسجة المشحونة بشكل سلبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنيات هي قدرتها على التنبؤ بشكل أفضل في الفعالية العلاجية الحية من خلال سلسلة من التجارب في المختبر التي تميز النقل المذاب من خلال الأنسجة.

أمراض الغضاريف, مثل هشاشة العظام, لا تزال غير المعالجة بسبب عدم قدرة الأدوية على اختراق مصفوفة الغضاريف الكثيفة, تتطلب من حاملي الأدوية مقدمة فعالية علاجية. تبدأ باستخدام مسح مهمة حساسة لإزالة بلطف برنامج تلفزيوني الزائدة من الأسطح من قطرها ثلاثة ملليمتر، واحد ملليمتر extilage سميكة explantage. استخدام التوازن لتسجيل الوزن الرطب بسرعة من كل explant ووضع فورا explants في حمام برنامج تلفزيوني لمنع الجفاف.

المقبل، إضافة 300 ميكرولترات من إعداد حديثا، 30 الفلورية micromolar المسمى ببتيد الموجبة حل الناقل في بئر إلى الآبار الداخلية من لوحة 96-جيدا واستخدام ملعقة لإضافة explant واحد إلى كل بئر من الحل. املأ كل بئر من الآبار المحيطة بـ 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني واغطي اللوحة بغطاء. ختم حواف لوحة مع فيلم مرن للحد من التبخر ووضع لوحة على شاكر في حاضنة درجة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في 50 الثورات في الدقيقة الواحدة، مع مدار 15 ملليمتر.

في نهاية الحضانة، نقل حمام التوازن من كل بئر إلى أنابيب البولي بروبلين الفردية وجعل التخفيفات التسلسلية من الأسهم 30 ميكرومولار الببتيد الحامل الحل لتوليد منحنى قياسي. ثم، نقل 200 ميكرولترات من كل حل والمعيار إلى آبار فردية من لوحة سوداء 96-well والحصول على قراءات الفلورنس لكل عينة ومعيار على أساس الإثارة وأطوال الموجات الانبعاثات من الملصق الفلورسنت. لتحديد عمق اختراق حاملة الببتيد الموجبة داخل explant الغضاريف، استخدم مشرط لخفض قطرها ستة ملليمترات، واحد ملليمتر سميكة الغضاريف explantage في النصف وترطيب القطع نصف القرص الناتجة مع مثبطات البروتين تكمل برنامج تلفزيوني.

تطبيق الايبوكسي إلى مركز بئر من غرفة النقل أحادية الأبعاد مصممة خصيصا وتأمين واحد explant نصف القرص داخل البئر مع الجانب السطحي من explant التي تواجه الجانب المنبع من الغرفة. إزالة أي الغراء الزائد من البئر لمنع الاتصال مع منطقة سطح الانتشار للغضاريف وإضافة 80 ميكرولتررس من مثبطات البروتياز مكملة برنامج تلفزيوني لكلا الجانبين من explant. الماصات السائل صعودا وهبوطا على جانب واحد من explant للتحقق من تسرب إلى الجانب الآخر.

إذا لم يكن هناك تسرب، استبدال مثبطات البروتياز مكملة برنامج تلفزيوني من الجانب المنبع مع 80 ميكرولترات من 30 مضرين micromolar المسمى محلول حامل الببتيد الموجبة ووضع بعناية غرفة النقل في طبق ثقافة الخلية. تغطية قاعدة الطبق مع برنامج تلفزيوني لتجنب الببتيد الموجبة حل التبخر. الحرص على عدم وجود اتصال مباشر بين الحلول من الغرف المنبعة والمصبية.

ضع الطبق المغطى على شاكر للحد من ترسيب الجسيمات لمدة أربع أو 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة و 50 ثورات في الدقيقة ، مع مدار 15 ملليمتر. في نهاية الحضانة، وإزالة explants من الغرفة وقطع ما يقرب من 100 ميكرون شرائح سميكة من مركز كل explant. ضع كل شريحة من الإكزلاق بين شريحة زجاجية وزلة غطاء وهيدرات الشرائح بمثبط البروتياز الطازج المكمل لبرنامج PBS.

قم بإصلاح الشريحة على خشبة المجهر confocal والحصول على Z-كومة من الصور الفلورية من خلال سمك كامل من شريحة في التكبير 10X. افتح ملف الصورة والصورة J، وانقر فوق صورة، وحدد مكدسات ومشروع Z من القائمة المنسدلة. ثم أدخل أرقام الشريحة من شريحة واحدة إلى الشريحة النهائية وتحت نوع الإسقاط، حدد متوسط الكثافة وانقر فوق "موافق".

لتقييم غير التوازن الببتيد الناقل معدل انتشار الغضروف، وتجميع كل نصف من غرفة النقل، لتشمل طوقا مطاطيا كبيرا واحدا، واحد إدراج بوليوميثيثيثهاكريلات، واحد طوقا مطاطي صغير. قياس سمك explant الغضروف، ثم وضع explant في آبار إدراج البلاستيك مع سطح سطحية تواجه غرفة المنبع وساندويتش نصفين معا لإكمال الجمعية. استخدام وجع لبرغي بإحكام أنصاف معا قبل ملء غرفة المنبع مع اثنين من ملليلتر من مثبطات protease مكملة برنامج تلفزيوني.

تحقق من غرفة المصب للتسرب من غرفة المنبع. إذا لم يتم الكشف عن تسرب، ملء غرفة المصب مع ملليلتر اثنين من مثبطات البروتياز مكملة برنامج تلفزيوني. أضف شريطًا صغيرًا واحدًا إلى كل من الغرف صعوداً وهابطاً ووضع الغرفة على لوحة مثيرة مع محاذاة الغرفة بحيث يركز الليزر من مقياس الطيف الضوئي نحو مركز غرفة المصب.

مع جزء مستقبل الإشارة من مقياس الطيفي خلف غرفة المصب، قم بجمع قراءات انبعاثات الفلورية المستقرة في الوقت الحقيقي لمدة خمس دقائق على الأقل. بعد الحصول على قراءة مستقرة، إضافة حجم محسوبة مسبقا من الفلورسنت المسمى محلول الأسهم الببتيد الموجبة الناقل إلى غرفة المنبع إلى تركيز حمام النهائي من ثلاثة ميكرومولار، ورصد إشارة الفلورسنت المصب في حين تسمح للنقل المذاب للوصول إلى زيادة مطردة في المنحدر. بمجرد التوصل إلى حالة ثابتة ، نقل 20 ميكرولترات من الحل من غرفة المنبع إلى غرفة المصب لاختبار ارتفاع وجمع قراءات الفلورانس في الوقت الحقيقي المصب.

ارتفاع جدا شحنة إيجابية سوف تحد من اختراق المذاب إلى المنطقة السطحية كما الناقل يربط بقوة جدا لمجموعات aggrecan المشحونة سلبا من مصفوفة الغضاريف. وعلى العكس من ذلك، تخترق الناقلات القادرة على الاستفادة من تفاعلات الشحن الضعيفة والقابلة للعكس المنطقة العميقة من الأنسجة. غير أن الناقلة للمخدرات المشحونة على النحو الأمثل لن تخترق المناطق العميقة من الأنسجة فحسب، بل ستثبت أيضاً امتصاصاً عالياً داخل الأنسجة، يمكن تحديدها باستخدام قياسات الفلورانس للحمام المتوازن والوزن الرطب للأنسجة، كما هو مبين.

وتسفر تجارب النقل غير المتوازن عن منحنى متولد من البيانات مع انحدار متزايد تدريجيا. الجزء الأولي من منحنى يمثل نشر منسّق من خلال الغضاريف كما تحدث التفاعلات ربط مصفوفة مذاب. بمجرد وصول السولوتات إلى غرفة المصب ، يزداد منحدر المنحنى مع زيادة قراءات الفلوريس مع مرور الوقت.

هذا الجزء الثاني من المنحنى ثم يصل إلى منحدر ثابت، يمثل انتشار حالة ثابتة. يشير تقاطع X لخط مظلي مرسوم عند جزء الحالة الثابتة من المنحنى إلى الوقت الذي يستغرقه الوصول إلى انتشار الحالة الثابتة أو تأخر تاو. وبعد نقل الحل من المنبع إلى غرفة المصب، لوحظ ارتفاع في الفلور، وعند هذه النقطة يمكن استخدام كثافة الفلورس المستقرة لربط الفلوري بالتركز.

ويمكن بعد ذلك حساب التمثيل الفعلي للانتشار وقيم الانتشار الثابتة للدولة، كما هو مبين. لاحظ أن الانتشارية الثابتة للدولة هي أمرين من الحجم أعلى من الانتشار الفعال نتيجة لجميع مواقع الربط القائمة على الشحن التي يتم احتلالها. وهكذا، في هذه المرحلة، يستند الانتشار إلى الحجم وليس على الشحن، مما يؤدي إلى قيم انتشار ثابتة مماثلة بين ا للبلدان المتوسطة الحجم من نفس الحجم.

الحفاظ على ترطيب النبات والتقليل من تبخر الحل طوال التجربة لمنع التغيرات في مورفولوجيا الغضاريف وتركيز الحل ، على التوالي ، وضمان الحصول على بيانات دقيقة وقابلة للاستنساخ. وبعد تصميم ناقل مخدرات مشحون على النحو الأمثل، يمكن استخدام تقنيات مختلفة من تقنيات الاقتران لتعديل العقاقير من أجل تحسين استهداف الأنسجة وتيسير تقييم فعاليتها البيولوجية.