تشريح وعزل الفئران الدبقية من مناطق الجهاز العصبي المركزي المتعددة

هذا البروتوكول مهم لأننا نتعلم أن الخلايا الدبقية غير متجانسة إقليميا ، شكليا ، وظيفيا ، ووراثيا. الميزة الأساسية لهذه التقنية هي أنه يمكنك دراسة ثلاث مجموعات فرعية منفصلة للخلايا الدبقية من أربع مناطق متميزة من الجهاز العصبي المركزي. سأثبت هذا الإجراء أنا وراشيل تينكي ، طالبة دراسات عليا في مختبري.

استخدم مقصا ناعما لقطع الطبقة الجلدية على طول خط الوسط لرأس الجرو ، وابدأ بالذيلية وتحريك المنقار حتى الوصول إلى الخطم. تجنب قطع الجمجمة بعمق لمنع أي تلف للأنسجة. قم بتحريك الرأس لأسفل ، واسحب الطبقة الجلدية إلى كل جانب من الجمجمة واستخدم مقص زنبركي لعمل شق على طول خط الوسط للجمجمة ، بدءا من الثقبة العظمى.

اسحب الجمجمة إلى نصفين بملقط رفيع يعرض القشرة والمخيخ وجذع الدماغ. بمجرد تعريضه ، ارفع الدماغ برفق من الجمجمة وضعه في طبق بتري بطول 10 سم مع 10 ملليلتر من PBS ومحلول المضادات الحيوية. تأكد من أن الدماغ لا يزال غير تالف مع توصيل الدماغ الخلفي.

اقرص المخيخ باستخدام ملقط منحني ناعم. ضعها في أنبوب مخروطي الشكل 15 مليلتر على الجليد. افصل منتصف الدماغ عن القشرة.

قم بإزالة السحايا القشرية وضعها في أنبوب مخروطي الشكل. يجب فحص الأنسجة بعناية لضمان الإزالة الكاملة للسحايا. إذا بقيت الخلايا السحائية في المزرعة ، فقد تكون ضارة بنمو الخلايا الدبقية.

لتشريح الحبل الشوكي ، ضعه في الجانب البطني لأعلى واستخدم مقصا زنبركيا ناعما لقطع الفقرات ، بالتناوب بين الجانبين الأيسر والأيمن حتى ينكشف نسيج الحبل الشوكي. قم بإزالة الحبل الشوكي والسحايا برفق ووضعها في الأنبوب المخروطي المخصص على الجليد. أضف ملليلتر واحد من 0.05٪ التربسين مع 0.53 ملليمولار EDTA إلى كل أنبوب به أنسجة.

قم بترتيبول الخليط بماصة سعة 10 ملليلتر حوالي 20 مرة. ثم انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي فارغ سعة 50 مل. احتضان المحلول عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 15 دقيقة.

تحريك المحلل بلطف بعد ثماني دقائق. بعد الحضانة ، أضف خمسة ملليلتر من MGM و 200 ميكرولتر من DNase I واحدا لكل أنبوب للحصول على تركيز نهائي يبلغ 50 ميكروغرام لكل مليلتر. قم بترثيل كل محللة 10 مرات بماصة سعة 10 مل.

ثم اترك تعليق الخلية لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح للأنسجة غير المنفصلة بالاستقرار في قاع الأنبوب. انقل معلقات الخلية إلى أنابيب مخروطية جديدة سعة 50 مليلتر تاركة وراءها الأنسجة غير المنفصلة. بعد الطرد المركزي ، قم بإعادة تعليق حبيبات الخلية في خمسة ملليلتر من MGM وقم بترتيترها 20 مرة قم بتعليق الخلية على قوارير T25 المطلية واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

قم بتغيير الوسائط بعد 24 ساعة لإزالة بقايا الخلايا. لإجراء عزل الخلايا السليفة قليلة التغصن ، رج الخلايا لمدة 15 ساعة ، ثم قم بإزالة المادة الطافية من القارورة ووضعها على طبق بتري معقم. احتضان المادة الطافية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة.

التحريك بعد 15 دقيقة لإزالة الخلايا الدبقية الصغيرة المتبقية. قم بإزالة المادة الطافية للخلايا غير الملتصقة ، وعد الخلايا ووضعها على سطح مطلي ب Poly-D-Lysine بالتركيز المطلوب. أعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة ساعة واحدة على الأقل.

ثم استنشق 95٪ من الوسائط برفق وأضف وسائط OPC الدافئة ببطء ، وقم بسحب ماصتها على جدار البئر لتقليل اضطراب OPCs. تم استخدام هذه الطريقة لإثبات أن إشارات إنترفيرون جاما تؤثر على تمايز OPC ونضجه. بدون مستقبلات جاما الإنترفيرون ، لا تتمايز OPCs القشرية إلى خلايا قليلة التغصن النخاعية الناضجة ، كما يقول بسهولة ، وهو ما يتضح من عدم وجود تلطيخ MBP.

كما تم تحليل التعبير عن GFAP. تعبر الخلايا التي تعاني من نقص إنترفيرون جاما بقوة عن GFAP ، مما يشير إلى أنها قد تتبنى نمطا ظاهريا فلكيا. يتضح عدم التجانس الإقليمي في خلايا الجهاز العصبي المركزي من خلال اختلاف مورفولوجيا الخلايا النجمية في القشرة والمخيخ وجذع الدماغ والحبل الشوكي.

قد تظهر الخلايا النجمية من نفس المنطقة أيضا عدم تجانس مورفولوجي ، مما يدعم فكرة أن هذا النوع الفرعي الدبقي ديناميكي للغاية. كما تم استكشاف الاستجابات الإقليمية ل OPCs لتحفيز السيتوكين التفاضلي. تؤثر إشارات السيتوكين بشكل كبير على سلوك الخلايا الجذعية والمناعية وقد تؤثر على كيفية تمايز OPCs إلى خلايا قليلة التغصن النخاعية الناضجة.

يمكن استخدام خلايا عزل الخلايا الدبقية الإقليمية في مجموعة متنوعة من الظروف التجريبية والحمضية باستخدام العديد من التقنيات بما في ذلك الكيمياء المناعية ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي ، والنشاف الغربي.