خط أنابيب باستخدام ثنائي في القطب الرحمي لاستجواب التأثيرات الوراثية على سلوك القوارض

يمكن أن يسمح استخدام هذه الطريقة باكتشاف كيف يمكن أن تعزى بعض التغييرات في التعبير الجيني إلى الأمراض المرتبطة بالأمراض العصبية. تتمثل ميزة هذه التقنية في أنها تتجاوز الحاجة إلى إنشاء أو شراء سلالات حيوانية وراثية قد تستغرق سنوات لإنشائها والتحقق من صحتها. تسمح هذه التقنية بدراسة الجينات المتورطة في الاضطرابات العصبية.

تحديد كيفية مساهمة جينات معينة في علم الأمراض خطوة مهمة في تطوير علاجات جديدة. تتمثل ميزة هذا البروتوكول في تعلم كيفية التلاعب بالأجنة بحيث ينجز المجرب خطوة نقل الجينات دون تقليل معدلات البقاء على قيد الحياة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا مهما لأن الأجنة هشة للغاية ، لذلك من المفيد ملاحظة كيفية التلاعب بها المجرب المتمرس أثناء العملية.

أحضر السدود الحامل إلى منطقة الجراحة قبل 30 دقيقة على الأقل من الجراحة. تعقيم موقع الجراحة بالكامل باستخدام مناديل معقمة مبيدات للجراثيم ثم 70٪ إيثانول. ثم تعقيم أدوات الأوتوكلاف في معقم حبة زجاجية.

انقل PBS المعقم إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مليلتر وضع الأنابيب في حمام مائي ساخن إلى 38 إلى 40 درجة مئوية. تحقق من درجة حرارة المحلول الملحي المعقم باستخدام مقياس حرارة. قم بتشغيل مضخة تدوير تسخين المياه بحيث يتم تسخينها إلى 37 درجة مئوية.

ثم قم بتشغيل حاقن الضغط والمثقب الكهربائي وتأكد من الوظيفة المناسبة. قم بتدوير محلول الحمض النووي للبلازما لفترة وجيزة على جهاز طرد مركزي منضدي وضعه على الجليد. اسحب الماصات الزجاجية على مجتذب الماصة بحيث يبلغ قطر طرف الماصة الزجاجية المسحوبة حوالي 50 ميكرومتر.

ثم املأ الماصة ب 20 إلى 40 ميكرولترا من محلول الحمض النووي. قم بإعداد جميع العناصر اللازمة للجراحة بما في ذلك غسول إزالة الشعر واليود والإيثانول بنسبة 70٪ ومسحات القطن وقطرات العين والخيوط والشاش. قم بإعداد ورقة الجراحة واملأ المعلومات اللازمة.

قم بوزن الماوس قبل الجراحة وسجل الوزن. بعد تخدير الفأر ، قم بإعطاء المسكنات قبل الجراحة وإزالة الفراء من البطن باستخدام كريم إزالة الشعر أو ماكينة الحلاقة. تعقيم البطن عن طريق مسحها باليود بوفيدون و 70٪ إيثانول ثلاث مرات.

قم بإنشاء حقل معقم حول البطن باستخدام شاش معقم ولف. قم بعمل شق خط الوسط في جلد البطن أثناء رفع الجلد بالملقط لتجنب قطع العضلات. ثم ارفع العضلات لأعلى واقطعها مع الحرص على تجنب قطع الأعضاء الحيوية.

اسحب قرون الرحم بحذر من السد باستخدام ملقط حلقي وضعها برفق على الحقل المعقم مع التأكد من أنها مدعومة بحشوة ولا تسحب بعيدا عن السد. حافظ على ترطيب قرن الرحم طوال الفترة المتبقية من الجراحة باستخدام PBS المعقم الدافئ مسبقا. ضع الجنين إما بالملقط أو الأصابع ، ثم أدخل الماصة الزجاجية المسحوبة بعناية في العمودي الجانبي وحقن اثنين إلى ثلاثة ميكرولتر في كل بطين عن طريق إدخال الماصة في أحد البطينين ثم البطين الآخر.

تم استهداف البطين بنجاح في حالة وجود شكل هلال بعد الحقن. لنقل الخلايا بشكل ثنائي في القشرة الأمامية ، ضع القطبين السالبين على جانبي رأس الجنين بشكل جانبي ذيلي قليلا للبطينين الجانبيين وضع القطب الموجب بين العينين أمام الخطم النامي مباشرة. تأكد من ترطيب الجنين بسخاء وتطبيق أربع نبضات مربعة.

حقن جميع الأجنة وتثقيتها كهربائيا ، وقم بإجراء واحدة تلو الأخرى بحيث يتم تزويد كل جنين بالكهرباء مباشرة بعد حقن محلول الحمض النووي. بمجرد أن يتم حفر جميع الأجنة بالكهرباء ، أدخل قرون الرحم بعناية مرة أخرى في تجويف البطن. قم بتغطية تجويف البطن ب PBS معقم للمساعدة في وضع قرن الرحم.

املأ تجويف البطن ب PBS المعقم حتى لا تبقى جيوب هوائية بعد اكتمال الخياطة. خياطة العضلات بخيوط قابلة للامتصاص والجلد بخيوط حريرية غير قابلة للامتصاص. اترك السد يتعافى تماما في غرفة ساخنة لمدة ساعة واحدة على الأقل.

تحقق من السدود بانتظام خلال ال 48 ساعة القادمة. عندما يتعافى السد من التخدير ويستعيد وعيه ، سيبدأ في التحرك والخفق. تم استخدام هذه الطريقة لنقل ما يقرب من 5،000 طبقة 2/3 من الخلايا العصبية الهرمية باستخدام بلازميد pCAG-GFP.

تم توطين معظم هذه الخلايا في المناطق القشرية الأمامية. يوضح مثال تمثيلي التوزيع الذيلي المنقاري للخلايا العصبية المنقولة في فأر التحكم البالغ ، مما يؤكد قدرة اللوات الدموية الثنائية على استهداف وتسمية مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية الهرمية في القشرة الأمامية وتصنيفها وراثيا. يختبر الجزء الأول من مهمة التفاعل الأمومي قدرة التحكم في الفئران المنقولة P18 للعثور على فراش العش.

أمضت الفئران الضابطة وقتا أطول في استكشاف فراش عشها بدلا من استكشاف الفراش الطازج ، مما يشير إلى أن لديهم قدرات حركية حسية سليمة وسلوك استكشافي. يستفيد الجزء الثاني من المهمة من ميل الفئران إلى أن تكون متحمسة للتفاعل مع والدتها. في هذه المهمة ، قضت الجراء معظم وقتها بالقرب من والدتهم بينما تقضي وقتا أقل بكثير في استكشاف الكوب الفارغ أو فراش العش.

أمضت الفئران البالغة ما يقرب من 35٪ من الوقت في استكشاف كائن جديد. عندما قدمت للفئران البالغة رواية وشيء مألوف ، أمضت المزيد من الوقت في استكشاف الكائن الجديد. في مهمة التواصل الاجتماعي ، أمضت الفئران البالغة وقتا متشابها في استكشاف فأر جديد وكوب فارغ.

تم تتبع هذا السلوك تلقائيا باستخدام برنامج DeepLabCut عن طريق تسمية نقاط مختلفة على الماوس ، بما في ذلك الأطراف والنقطة الوسطى والرأس والأذنين. تم استخدام البرنامج أيضا لتحديد وقت تربية الفئران عن طريق فحص طول جسم الفأر لأن هذه المسافة تصبح أقصر عندما يرتفع الفأر. باتباع هذا الإجراء ، يمكن الإجابة على العديد من الأسئلة الجزيئية الخلوية من خلال فحص الأنسجة وفحص مقاييس مختلفة مثل كثافة العمود الفقري أو مستويات التعبير عن البروتينات المختلفة.