الموجات فوق الصوتية المركزة التي تحفز فتح الحاجز الدموي الدماغي لاستهداف هياكل الدماغ وتقييم التعديل العصبي الكيميائي الوراثي

يحدد هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لتوصيل الجينات من خلال فتح حاجز الدم الدماغي بالموجات فوق الصوتية المركزة (BBB) ، وتقييم التعبير الجيني الناتج ، وقياس نشاط التعديل العصبي للمستقبلات الكيميائية الجينية من خلال الاختبارات النسيجية.

يتيح بروتوكولنا استهداف الدقة دون المليمترية للموجات فوق الصوتية المركزة في الفئران. يسمح لنا باستهداف الموجات فوق الصوتية باستخدام أجزاء مطبوعة ثلاثية الأبعاد غير مكلفة دون الحاجة إلى استخدام الجراحة أو معدات الموجات فوق الصوتية المتوافقة مع التصوير بالرنين المغناطيسي. يمكن أن يكون فتح الحاجز الدموي الدماغي المركز بالموجات فوق الصوتية أمرا صعبا للغاية في البداية.

من الأهمية بمكان أن يتم ربط محول الطاقة بشكل صحيح بالحيوان باستخدام هلام أو ماء منزوع الغازات وعدم انهيار الفقاعات الدقيقة أثناء الحقن. سيوضح الإجراء ريتشارد لي ، طالب الدراسات العليا في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا. بعد التأكد من عدم الاستجابة لانعكاس الدواسة في فأر مخدر ، استخدم 10 وحدات لكل مليلتر من محلول ملحي هيبارين لغسل قسطرة نظيفة من 25 إلى 35 واستخدم وسادة إيثانول لتطهير ذيل.

أدخل القسطرة في وريد الذيل الجانبي واستخدم غراء المناديل لتثبيت القسطرة في مكانها. إذا تم وضع الإبرة بشكل صحيح ، ملاحظة ارتداد الدم في القسطرة. عندما يجف الغراء ، قم بإزالة الشعر على رأس باستخدام كريم إزالة الشعر وضع الماوس في عربة التصوير بالرنين المغناطيسي المطبوعة ثلاثية الأبعاد ، وتركيب الأسنان الأمامية على شريط لدغة مع وجود الرأس داخل مخروط الأنف.

قم بتثبيت القضبان الضعيفة على الجمجمة بقدر آمن من الضغط وراقب التنفس لمدة 30 ثانية للتأكد من أن يتنفس بحرية بمعدل نفس واحد في الثانية. قم بتوصيل دليل الاستهداف بقضبان الأذن وتحقق من التنفس مرة أخرى. ضع عربة التصوير بالرنين المغناطيسي في حامل التصوير بالرنين المغناطيسي وضع الحامل داخل تجويف المغناطيس.

ثم احصل على تسلسل التصوير بالرنين المغناطيسي لتوطين الماوس في الماسح الضوئي ، باستخدام تسلسل اللقطة ثلاثي الأبعاد سريع بزاوية منخفضة لتصوير الدماغ بأكمله. لإجراء استهداف موجه بالرنين المغناطيسي ، ضع العربة داخل أداة تجسيمية واستخدم كتلة معدنية بشريط على الوجهين لتثبيت الكتلة في مكانها مقابل عمودي دعم للأداة التجسيمية. انقل صور التصوير بالرنين المغناطيسي إلى جهاز كمبيوتر باستخدام برنامج توجيه الموجات فوق الصوتية المركز قيد التشغيل ، وافتح الصور.

عند تحميل جميع الصور ، انقر بزر الماوس الأيمن وانقر فوق إعادة التأهيل لإعادة تنسيق الصورة إلى ثلاثة محاور. انقر بزر الماوس الأيمن لترجمة محول الطاقة إلى دليل الاستهداف الدائري. في العرض السهمي ، اضبط الوضع الرأسي لمحول الطاقة الافتراضي لحساب سمك الحمام المائي ومبيت محول الطاقة.

حدد المناطق المراد استهدافها في مخطط المسار ولاحظ الإحداثيات في جدول بيانات. اطلب العمق المطلوب للاستهداف ولاحظ الإحداثيات كما هو موضح سابقا. ثم انقر فوق إرسال المسار والتنفيذ لاستهداف كل نقطة من النقاط.

لربط إحداثيات التصوير بالرنين المغناطيسي بالإطار التجسيمي ، ضع محول الطاقة المثبت حسب الطلب فوق دليل الاستهداف وترجم حتى يمكن لكل من مسامير الاستهداف الثلاثة المرور عبر كل من حامل محول الطاقة ودليل الاستهداف. تأكد من أن البراغي ليست تحت الشد أو الإمالة وقم بترجمة محول الطاقة 10.56 ملم للأمام في الاتجاه الأمامي الخلفي حتى يقع محول الطاقة عند النقطة التي يظهر فيها مركز دليل الاستهداف على التصوير بالرنين المغناطيسي. ثم حدد المسافة من مركز محول الطاقة الظاهري إلى المنطقة المستهدفة واستخدم الإطار لتحريك محول الطاقة إلى هذه الإحداثيات.

لتحضير محلول الحقن ، قم بتحميل 800 ميكرولتر من المحلول الملحي و 100 ميكرولتر من عامل تباين التصوير بالرنين المغناطيسي في أنبوب 1.5 مليلتر مع الخلط. بعد ذلك ، أحضر محلول الفقاعات الدقيقة غير المنشط إلى درجة حرارة الغرفة ، قبل تنشيط الفقاعات الدقيقة لمدة 45 ثانية في جهاز تنشيط الفقاعات الدقيقة. بعد التنشيط ، قم بتحميل 100 ميكرولتر من الفقاعات الدقيقة ببطء من منتصف المحلول في حقنة درنة سعة مليلتر واحد مزودة بإبرة قياس 21 ، وأضف 80 ميكرولترا من الفقاعات الدقيقة في محلول عامل التباين.

امزج المحلول المحضر عن طريق قلب أنبوب 1.5 مليلتر برفق لمدة 15 ثانية لتجنب التعويم. في نهاية الخلط ، قم بتحميل 200 ميكرولتر من محلول الفقاعات الدقيقة في حقنة بدون إبرة وقلب المحقنة. اضغط على المكبس وسحبه لخلط وإرفاق إبرة قياس 30 بالمحقنة بينما لا تزال مقلوبة.

ثم ادفع محلول الفقاعات الدقيقة ببطء حتى تظهر قطرات في نهاية الإبرة. بمجرد أن تصبح الفقاعات الدقيقة جاهزة ، اضبط مدة النبضة للرنين على 10 مللي ثانية ، مع 120 تكرارا كل ثانية ، مع 0.3 إلى 0.45 ميجا باسكال من الضغط عند الجمجمة. قم بإزالة دليل الاستهداف وقم بتطبيق جل الموجات فوق الصوتية منزوع الغازات على رأس الماوس ، مع الحرص على تجنب الفقاعات.

اخفض محول الطاقة حتى يتم وضعه مباشرة على الجزء المسطح من حامل قضيب الأذن واطلب الإحداثيات في الأدوات التجسيمية. تمييع الفيروس المرتبط بالغدة ذات الأهمية إلى 0.5 إلى 2 في 10 إلى 10 إلى 10 جسيم فيروسي لكل جرام من تركيز وزن الجسم ، وتحميل جزيئات الفيروس في حقنة سعة ملليلتر واحد مزودة بإبرة قياس 30. حقن المحلول في قسطرة وريد الذيل وحقن 80 ميكرولترا من محلول الفقاعات الدقيقة في الماوس.

لتقييم فتح الحاجز الدموي الدماغي بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي ، سجل تسلسل سريع لقطة بزاوية منخفضة كما هو موضح. لتحفيز DREADD ، قم بإذابة أكسيد N كلوزابين في محلول ملحي معقم بتركيز واحد ملليغرام لكل مليلتر ، وحقنه داخل الصفاق. بعد 15 إلى 45 دقيقة من الولادة ، ابدأ في تسجيل النشاط السلوكي للحيوان.

لتحليل تنشيط الخلايا العصبية ، استخدم أنسجة الدماغ. باتباع البروتوكول كما هو موضح ، يمكن تحقيق تحسين إشارة T1 في منطقة الحصين وفي أجزاء أخرى من الدماغ. كما لوحظ ، يؤدي التلوين المناعي ضد mCherry إلى اكتشاف أكثر موثوقية لتعبير DREADD في هذا الإجراء ، تذكر التعامل مع الفقاعات الدقيقة برفق والتأكد من استقرار أثناء تصوير التصوير بالرنين المغناطيسي والرنين.