توصيف الخلايا المناعية والوسطاء الالتهابيين في البيئة الرئوية

يمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في التغيرات في البيئة الرئوية بعد السكتة الدماغية الإقفارية. تسمح هذه الطريقة بتحديد 13 نوعا من الخلايا المناعية الرئوية و 13 نوعا مختلفا من السيتوكينات والكيموكينات في نفس الفأر عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي. تم استخدام هذه الطريقة لتقييم التغيرات في البيئة الرئوية بعد السكتة الدماغية الإقفارية.

ومع ذلك ، يمكن أن يعمل أيضا على التحقيق في التغييرات أثناء الاستجابة التحسسية أو العدوى. لإجراء نضح عبر القلب لكامل الجسم ، تأكد من عدم وجود استجابة لانعكاس الدواسة في فأر مخدر وقم بتأمين الفأر في منصة جراحية. بلل الفراء بنسبة 70٪ من الإيثانول لتقليل توزيع الفراء في تجويف الجسم وعمل شق جلدي عمودي في خط الوسط لكشف الصفاق السليم ، مما يوقف الشق بمجرد الوصول إلى التجويف الصدري.

استخدم مقص تشريح دقيق لعمل شق خط الوسط في الصفاق يتوقف عند التجويف الصدري قبل ذلك واستخدم الملقط لإمساك الطرف البعيد من القص. استخدم المقص لقطع الحجاب الحاجز دون الإضرار بالقلب أو الرئتين أو الأوعية الدموية. عندما تكون الأنسجة الأساسية مرئية ، قم بعمل شق في القفص الصدري وقم بتأمين جوانب الأضلاع بحيث يتعرض القلب والرئتين بالكامل.

قم بعمل شق صغير بعناية في الأذين الأيمن بالقرب من قوس الأبهر ليكون بمثابة تدفق للتروية وأدخل إبرة قياس 25 بسرعة ولكن برفق في السطح العلوي البعيد للبطين الأيسر. بمجرد وضع الإبرة في مكانها ، اغسل برفق 10 مل من PBS البارد في القلب. يجب أن تبدأ الأنسجة في التخلص من الدم.

عندما يتم تسليم الحجم بالكامل ، قم بنشر كمية ثانية من 10 ملليلتر من PBS البارد حتى يظهر الكبد مظهرا بنيا فاتحا وتنتقل الرئتان من اللون الوردي المحمر إلى اللون الأبيض في الغالب. باستخدام ملقط ومقص تشريح دقيق ، قم بإزالة جميع الأنسجة المحيطة بعناية قبل فصل فصوص الرئة ووضعها في طبق بتري يحتوي على واحد إلى ملليلتر من خلايا الرئة الباردة ، متوسطة على الجليد. لتحضير أنسجة الرئة لمصفوفات الخرز متعددة الإرسال ، أضف 200 ميكرولتر من مخزن التجانس البارد إلى أنبوب سعة ملليلتر يحتوي على ثلاثة حبات معقمة سعة 2.3 ملليلتر من الزركونيا / السيليكا ، وقم بوزن فص الرئة المهم.

انقل 50 إلى 100 ملليغرام من أنسجة الرئة إلى أنبوب الخرز المبرد مسبقا ومخزن التجانس وقم بتجانس الفص باستخدام الخالط القائم على الخرزة عند 4،000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين على الأقل. عندما يتم تجانس الأنسجة تماما ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لترسيب الأنسجة ونقل الأنبوب الفائق إلى أنبوب دقيق مبرد مسبقا سعة 1.5 مليلتر على الجليد. لتفكك أنسجة الرئة ، قم بتفريغ وسط خلية الرئة بعناية من فص الرئة المتبقي وأدخل إبرة قياس 25 في الأنسجة.

حقن 200 إلى 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفكك في كل فص رئة لتضخيم الرئتين حتى يتم حقن كل فص مرتين إلى ثلاث مرات. بعد حضانة لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، استخدم مقص تشريح ناعم لفرم الرئتين إلى قطع صغيرة ونقل محلول الأنسجة إلى أنبوب كرونيكل سعة 15 مل. أضف ستة ملليلتر من المخزن المؤقت الإضافي للتفكك إلى العينة والدوامة بقوة لمدة دقيقة واحدة.

بعد ذلك ، احتضان قطع المناديل لمدة 45 دقيقة عند دوامة 37 درجة مئوية كل سبع إلى ثماني دقائق. في نهاية الحضانة ، قم بدوامة العينة بقوة لمدة دقيقة واحدة وقم بتمرير العينة عبر مصفاة خلية 100 ميكرون لإزالة أي نسيج ضام وخلالي متبقي غير مرغوب فيه. جمع الأنسجة عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليقها على الحبيبات مع خمسة ملليلتر من وسط الرئة الباردة.

الطرد المركزي العينة مرة أخرى وإعادة تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من وسط الرئة الباردة مع دوامة لطيفة. بعد ذلك ، قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة 100 ميكرون قبل العد. لتقييم مجموعات الخلايا المناعية داخل أنسجة الرئة المعزولة ، قم بزرع الجسم المضاد من 10 إلى 10 إلى خلايا الطاقة السادسة في العدد المناسب من الآبار مع صفيحة سفلية مستديرة 96 جيدا وتخلص من الخلايا إلى قاع اللوحة عن طريق الطرد المركزي.

أضف 25 ميكرولترا من كوكتيل الأجسام المضادة المناسب في مخزن FACS البارد إلى كل بئر واخلطه مع ملاعبة الأنابيب اللطيفة. بعد 20 دقيقة ، أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من عازلة FACS الباردة لكل بئر وانقل العينات إلى أنابيب فول دائرية من البوليسترين سعة خمسة ملليلتر تحتوي على 150 ميكرولتر من عازلة FACS الإضافية لكل أنبوب. بعد ذلك ، قم بتحليل العينات على الفور على مقياس التدفق الخلوي وفقا لبروتوكولات تحليل التدفق الخلوي القياسية.

في هذا التحليل التمثيلي ، تم تحديد 13 مجموعة مختلفة من الخلايا المناعية في الرئتين باستخدام ثلاث مجموعات من خمس إلى سبع مجموعات من الأجسام المضادة. تم استبعاد الخلايا الميتة باستخدام بقعة حية ميتة وتم تمييز أنواع الخلايا المناعية المختلفة باستخدام الأجسام المضادة والعلامات المدرجة في الجدول. تم تحديد الضامة السنخية والخلالية ، والخلايا المتغصنة الإيجابية CD103 و CD11B الإيجابية والحمضات في المجموعة الأولى.

تم تحديد الخلايا الوحيدة المؤيدة للالتهابات والعدلات في المجموعة الثانية وتم تحديد الخلايا التائية الإيجابية CD4 و CD8 الإيجابية ، والخلايا البائية ، والخلايا المتغصنة البلازمية ، والخلايا الطبيعية ، وخلايا NKT في المجموعة الثالثة. كان العدد الإجمالي للخلايا القابلة للحياة النسبة المئوية للخلايا الإيجابية CD45 والعدد الإجمالي للخلايا الإيجابية CD45 التي تم الحصول عليها متشابهة بين مجموعات الخلايا التي تم عزلها كما هو موضح ومجموعات الخلايا التي تم عزلها باستخدام مفكك الأنسجة المتاح تجاريا. بالإضافة إلى ذلك ، كانت النسبة المئوية لموت الخلايا بين الخلايا الإيجابية CD45 أقل من 10٪ لكلا البروتوكولين ، مما يشير إلى أن البروتوكول المثبت يسهل العائد العالي وجودة الخلية العالية دون مساعدة من مفكك الأنسجة الآلي.

علاوة على ذلك ، فإن استخدام مقايسة متعددة الإرسال المتاحة تجاريا إلى جانب تحليل قياس التدفق الخلوي يسمح بتحديد تركيز الكيموكين في كل عينة لكل ملليغرام من الأنسجة. يؤثر تركيز الكولاجيناز D ووقت الحضانة ودرجة الحرارة المستخدمة أثناء عزل الخلية المفردة بشكل حاسم على استعادة الخلايا المناعية.