التحقيق في حركية Flagella يحركها في الإشريكية القولونية من خلال تطبيق ثلاث تقنيات راسخة في سلسلة

يمكن إعادة إنتاج البروتوكولات الموضحة في هذا الفيديو في أي مختبر في العالم. مجتمعة ، فإنها تمثل نهجا منهجيا وقويا لتوصيف حركة السوط البكتيري. تعد الحركة جانبا مهما من انتشار البكتيريا وبقائها على قيد الحياة ، وهذه الطرق الثلاث هي أدوات مفيدة وقوية لتحليل الحركة الفردية والجماعية.

يمكن تطبيق التقنيات الموضحة هنا بسهولة لدراسة مجموعة من البكتيريا ، بما في ذلك تلك المصنفة على أنها مسببة للأمراض بطبيعتها. عند محاولة هذا الإجراء لأول مرة ، ضع في اعتبارك أنه إذا تم تحضير ألواح السرب بشكل غير صحيح ، فقد يتم ملاحظة سلوك أو أنماط غير متسقة تحاكي الحركة الجماعية ولكنها لا تعكس حقا الحركة الجماعية. تنمو الثقافات بين عشية وضحاها من سلالة نقص الحركة المرغوبة في خمسة ملليلتر من مرق لينوكس عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز الأفقي ، ثم الزراعة الفرعية في LB الطازج في نفس الظروف إلى المرحلة الأسية.

قم بتلقيح ستة ميكرولترات من المزرعة في وسط لوح أجار ناعم، وادفع طرف الماصة المحمل إلى الأجار لطرد المحتويات برفق. احتضان اللوحة عند 30 درجة مئوية حتى تظهر توهجات الحركة ، المنبثقة من نقطة التلقيح أو محيط حلقات الحركة. استخدم حلقة سلكية معقمة لرفع الخلايا من منطقة التوهج وخطها على صفيحة أجار صلبة LB من أجل تنقية المستعمرات المفردة.

للتأكد من أن الطفرات المثبطة المعزولة قد استعادت الحركة ، قم بزراعتها على ألواح أجار ناعمة للحصول على سلالات ذات أهمية. تشمل النوع البري وسلالة نقص الحركة الأولية للمقارنة. بعد احتضان ألواح الاستزراع عند 30 درجة مئوية لمدة ثماني إلى 10 ساعات ، قم بتسجيل قطر الحلقة الخارجية لتحديد أي من العزلات قد استعادت الحركة بشكل كبير.

قم بإعداد ثقافة المرحلة الأسية للسلالة ذات الاهتمام. ثم بيليه 10 مل من الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 2000 مرة G لمدة ثلاث دقائق ، وأعد تعليقها في 10 ملليلتر من المخزن المؤقت للحركة المعقم بالمرشح ، أو MB. اغسل الخلايا مرتين أخريين في ميغابايت وأعد تعليقها في مليلتر واحد من ميغابايت بعد الطرد المركزي النهائي. انقل تعليق الخلية إلى حقنة سعة مليلتر واحد وقم بإرفاق إبرة قياس 23 في النهاية.

قم بتجميع حقنة وإبرة متطابقة وقم بإرفاق الاثنين معا عبر ست بوصات من أنابيب البولي إيثيلين ، مغلفة بإحكام فوق كل طرف إبرة. قص السوط عن طريق تمرير تعليق الخلية برفق ذهابا وإيابا من حقنة إلى أخرى 50 مرة مع توقف لمدة دقيقة واحدة بين كل 10 تمريرات. ثم قم بالطرد المركزي للخلايا المنفصمة عند 2000 مرة G لمدة ثلاث دقائق وأعد تعليقها في 500 ميكرولتر من MB.To لإعداد غرفة تثبيت الخلية ، وقم بتكديس غطاء 18 × 18 ملم فوق شريحة مجهر زجاجي مفصولة بشريط على الوجهين.

أضف محلول بوليسين 0.01٪ إلى الجزء العلوي من الغرفة لشطفها. قم بإمالة الحافة السفلية على مسح المهام لسحب المحلول عبر الغرفة ، ثم اتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. اغسل الغرفة ثلاث مرات باستخدام 40 ميكرولتر من ميغابايت وأضف 40 ميكرولترا من تعليق الخلية المنفصمة إلى الجزء العلوي من الغرفة.

اسمح للخلايا بالالتصاق بزلة الغطاء لمدة 10 دقائق ، ثم اغسل الغرفة برفق ب 40 ميكرولتر من ميغابايت لإزالة الخلايا غير المتصلة. انقل الشريحة إلى مرحلة المجهر واستخدم الفحص المجهري لتباين الطور وهدف 100X لمسح السكان بحثا عن الخلايا المثبتة في مكانها وتدور على محور واحد. افتح برنامج المجهر ، وتأكد من أن الخلايا في بؤرة التركيز ، وابدأ في الحصول على الفيديو لتسجيل دوران الخلية لمدة دقيقة واحدة.

من تشغيل الفيديو ، حدد عدد الدورات الكاملة في الدقيقة وعدد المرات التي تغير فيها الخلية اتجاهها. قم بتلقيح ستة ميكرولترات من الثقافة الأسية المتوسطة عن طريق اكتشافها فوق الأجار. اترك الغطاء مغلقا لمدة خمس إلى 10 دقائق واستبدله عندما يجف اللقاح في سطح الأجار.

ثم احتضان الطبق عند 30 درجة مئوية لمدة ثماني ساعات. صب ما يقرب من 30 مل من أجار السرب في الغرفة اليمنى لطبق بتري مزدوج المقصورة ، مع التأكد من أنه مستوي مع المقسم البلاستيكي بين الغرف ، ولكن لا يفيض في اليسار. بعد تصلب الأجار ، املأ الغرفة اليسرى بحوالي 30 مل من أجار السباحة أو السرب.

قبل أن يتم ضبطه ، استخدم طرف ماصة معقمة لدفع الأجار برفق فوق الحدود وربط الجانبين بجسر أجار بطول ملليمتر واحد يمتد على طول الفجوة بالكامل. اترك الطبق يجف في درجة حرارة الغرفة. أثناء صب الأجار ، انتبه إلى عمقه.

إذا كان مرتفعا جدا ، فسوف يفيض. إذا كان منخفضا جدا ، فلن تتمكن من ربط الغرفتين. تم استخدام هذا البروتوكول لعزل التوهجات المرتدة الزائفة في سلالة الإشريكية القولونية المتحولة المزدوجة مع ضعف الحركة.

أظهر أحد هذه المرتدات حركة قريبة من النوع البري. تم استخدام السلالة الأم المتحولة المزدوجة والسلالة البرية متساوية الجين كعناصر تحكم. تم تحليل لقطات الفيديو لحساب الدورات في الدقيقة ، وجزء الوقت الذي تدور فيه المحركات في اتجاه عقارب الساعة ، أو انحياز التعثر.

أظهر متحور yhjH بعض الدورات في الدقيقة وانحيزا أقل للتعثر مقارنة بالإشريكية القولونية من النوع البري ، كما هو متوقع. أظهر كل من المتحولة المزدوجة ومثبطها سلوكا حركيا مشابها للنوع البري. تم استخدام اختبار عبور الحدود لمقارنة قدرات النوع البري وعزل القامع على السرب ثم التحرك عبر الحدود والسرب على أجار مكمل بالكاناميسين.

أظهرت كلتا السلالتين معدلات احتشاد متشابهة من نقطة تلقيح متطابقة ، لكن تقاطع السرب إلى غرفة المضادات الحيوية كان أكبر باستمرار بالنسبة للنوع البري من المثبط. كان الفرق بين السلالتين أكثر وضوحا عند تركيزات الكاناميسين الأعلى. قد يكون إعداد فحوصات السرب أمرا صعبا.

قد تحتاج إلى قضاء بعض الوقت في تحسين ظروف الرسم لتناسب البكتيريا التي تهمك ، بالإضافة إلى ظروف المختبر أثناء إعداد الوسائط. تم تطبيق التقنيات الواردة في هذا البروتوكول على مجموعة من البكتيريا السوطية ، ومن المحتمل أن يتم تطبيقها على عدد كبير من الأنواع غير المختبرة.