العيش الخلية إلى الأمام النهج الجيني لتحديد وعزل المسوخ التنموية في الكلاميديا trachomatis

يوفر هذا البروتوكول أداة فريدة من نوعها لتوليد وعزل الكلاميديا مع الملامح التنموية المتغيرة، مما يسمح في نهاية المطاف لتحديد الجينات التي تنظم دورة النمو. المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي القدرة على تتبع تطور نوع الخلايا الكلاميديا في الوقت الحقيقي والقدرة على عزل الكلاميديا ، مع برامج تنموية التغيير. لمُتَجَاة مراسل الكلاميديا تراشوماتيس، رأى مخزوناً من الكلاميديا يحتوي على ما يقرب من ثلاث مرات من العاشرة إلى الهيئات الابتدائية السابعة.

تحولت مع البلازما مراسل من الفائدة وبيليه ، يتم تخزين الفكر من قبل centrofugation. استخدام سونيكيشن في 10٪ السلطة لمدة 10 ثانية، لإعادة بناء الهيئات الابتدائية في 100 ميكرولترات من العازلة الأيض العرضي وتقسيم تعليق الجسم الابتدائية الناتجة بالتساوي، بين اثنين من 1.5 ملليلتر أنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة. إضافة 50 microliters من حل الأيض EMS أعدت حديثا في aliquots الكلاميديا للمطفرة و 50 microliters من العازلة الأيض vaccinic إلى aliquot الكلاميدي فقط لمتاجنسيس المخزون واحتضان كل من العينات لمدة 20 دقيقة، في درجة حرارة الغرفة.

EMS هو معروف ارتداء قفازات مادة مسرطنة أثناء المناولة، ونقع جميع المعدات الملوثة EMS والمتوسطة، في أحد الهيدروكسيد الصوديوم ضرس لمدة 24 ساعة قبل التخلص منها. لإقامة ثقافة الجملة، لتصوير وعزل التراخوميات mutigenized. بذور ستة لوحات القاع الزجاج جيدا، مع ست مرات 10 إلى التكلفة الخامسة سبع خلايا، في مليلتر اثنين من المتوسط الكامل في البئر وبذر 24 لوحة البوليسترين جيدا مع 10 إلى السبب الخامس سبع خلايا في ملليلتر واحد من المتوسط الكامل في البئر.

لتصيب ثقافة الخلية المضيفة مع المطفرة ينكر الكلاميديا trachomatis تصيب، خمسة ويلز من لوحة زجاجية القاع مع ما يقرب من ست مرات 10 إلى الخامس، من الهيئات الابتدائية المطفرة. في 1.5 ملليلتر من الجليد البارد HBSS في البئر. وتصيب البئر المتبقي ، مع ما يقرب من مرتين 10 إلى الهيئات الأولية الخامسة المطفرة الوهمية في 1.5 ملليلتر من الجليد البارد HBSS لكل بئر ، بعد حضانة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية ، مع هزاز ، وغسل الخلايا المصابة مع 37 درجة مئوية HBSS تكملها واحد ملليغرام لكل ملليلتر من الهيبارين ، تليها على الفور شطف HBS.

غسل الخلايا مع الهيبارين مرة أخرى، تليها على الفور اثنين من الشطف مع HBSS وحدها لضمان إزالة كل من الهيبارين. بعد الغسيل الأخير، أضف أربعة ملليلترات من 37 درجة مئوية متوسط التصوير، إلى كل بئر. وملء مساحات الآبار البينية بـ 37 درجة مئوية من المياه غير المؤينة ثم ضع اللوحات في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 10 ساعات.

في نهاية الحضانة تعيين حاضنة مرحلة المجهر إلى 5٪ ثاني أكسيد الكربون، و 37 درجة مئوية. ووضع ستة لوحة أسفل الزجاج جيدا، في حاضنة المرحلة. في برنامج التصوير ، استخدم المكون الإضافي لفحص المحتوى العالي لتحديد قالب لوحة الآبار الستة ، وإنشاء قائمة موضع تصوير تتكون من 12 حقل عرض لكل بئر استخدم خيار التركيز التلقائي لتعيين التركيز للتصوير الآلي وتعيين التعرض إلى 250 مللي ثانية بكثافة 4٪ في قناة GFB و 18٪ في الكثافة في قناة RFP.

حتى في دورة التصوير لمدة 24 ساعة ، مع فترات 30 دقيقة ، لالتقاط حركية دورة النمو وتعيين التقاط الصور لتشمل عدة مكدسات Z مع مجموعة من التركيز الذي ينتهي على جانبي شريحة InFocus ، ثم حدد Z النسبية للتصوير ، وشرائح متعددة في نافذة الاستحواذ واستخدام خيار ملف كومة الصور. لتعيين الصور ليتم حفظها كملفات مكدس TIFF. لتحديد مسارات التضمين ، مع تغيير ملفات تعريف التطوير ، استخدم خلية الاستيراد في شاشة EMS ، دفتر ملاحظات Python markdown ، لاستيراد بيانات تتبع التضمين من النقاط في إحصاءات المسار ، ملفات CSV في إطار بيانات الباندا.

استخدام الخلية لحساب حساب الوقت ليكون أقصى تعبير لكل من المراسلين في وقت مبكر ووقت متأخر لكل مسار واستخدام حزمة تعبئة خوخه، في نصف الحد الأقصى مؤامرة الخلية، لتصور الوقت اثنين نصف أقصى التعبير إلى نصف أقصى التعبير ضد ذلك من حفلة موسيقية hctB. استخدم مستكشف معرف المسار التفاعلي Bokeh، لتحديد التضمينات من السكان المتحولين، التي تقع خارج سحابة التشتت الوهمية المعالجة. لتصور التغيرات في التعبير المروج الحركية بشكل حيوي في الرسم البياني لخلية الدم المتحركة كثافة التعبير من حفلة موسيقية EOU ضد حفلة موسيقية hctB.

ثم تصور لقطة من الرسم المتحرك، في خلية محدد موقع التضمين. لعزل نيوتن التنموية، من إدراج الفائدة، وضع مجال الرؤية على بئر مع إدراج محدد، وتمرير الإبرة على المرحلة التفاضلية النقيض من الضوء ضوء ضوء مصدر قناة، لتصور الإبرة، واستخدام 595 نانومتر، قناة الإثارة، لتصور الهيئات الابتدائية لاستخراج. واستخدام التعديل الدقيق والمتلاعب الجزئي، للمناورة إبرة شعرية لإدراج، وتمزق إدراج مع الإبرة، واستخدام الحقن الدقيقة لرسم الهيئات الابتدائية في طرف إبرة شعرية.

طرد الهيئات الابتدائية المستخرجة، من إبرة الشعيرات الدموية إلى بئر واحد، من لوحة البوليسترين 24 جيدا، واستخدام إبرة شعرية جديدة لاستخراج المقبل. بعد توسع كاف من كل عزل، تعطيل monolayer المصابة مع طرف ميكروبيبت ميليتر واحد ونقل حطام الخلية المتوسطة وأطلق الكلاميديا في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentrifuge. بيليه الكلاميديا المحصودة عن طريق الطرد المركزي، وإعادة تعليق بيليه في 75 ميكرولترات من الجليد البارد، sucrose الفوسفات العازلة الغلوتامات، ثم تقسيم تعليق إدراج بالتساوي، بين ثلاثة جديدة 1.5 ملليلتر المسمار قبعة برغي أنابيب الطرد المركزي الصغيرة، وتخزين الأنابيب في ناقص 80 لقراءة مئوية.

لإعداد ثقافة الخلية المضيفة لتصوير المطفرة ISED يعزل البذور 96 بئرا الزجاج أسفل لوحة مع 1.6 مرات 10 إلى التكلفة الرابعة سبع خلايا، في 100 ميكرولترات من المتوسط الكامل في البئر. بعد أن تصل الخلية المضيفة monolayer ذوبان التقاء المستنسخات متحولة حصادها والبرية من نوع الأسهم الكلاميديا على الجليد واستخدام عمود واحد لكل عزل لأداء، وتمييع المسلسل شقين من كل عزل متحولة. تصيب ، والعمود المتبقي مع الكلاميديا من نوع البرية ، في تعدد العدوى من حوالي 0.5 ، ووضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 10 ساعات في نهاية الحضانة ، واختيار ثلاثة آبار لكل عزل متحولة التي تتوافق مع تعدد العدوى من أقل من واحد ، وتوليد قائمة موقف التصوير.

تتكون من حقلين من وجهات النظر في بئر. في هذا الثرثرة، والوقت إلى نصف التعبير الأقصى من EOU وhctB المروجين من عزل الكلاميديال الفردية يمكن أن يلاحظ استنساخ A3667 وB3858 انتخب للعزلة لأنها أنتجت أوقات أقصر أن يكون التعبير الأقصى، من المروج EOU وأطول مرات hctB أربع. يمكن تحديد التضمينات مع حركية غيرت على أساس التصور، من التعبير الجيني الديناميكي من المروجين اثنين، ويمكن استخدام لقطة من الرسم البياني المتحركة، لتحديد موقع إدراج الفائدة.

في هذه التصورات التمثيلية ، تم تحديد ما مجموعه 24 إدراجًا للعزلة ، 10 منها أظهرت حركية تفاضلية ، عند إعادة الاختبار في ثلاث فئات مختلفة من الظواهر الظاهرية ، أظهرت ثمانية عزلات التعبير المُعزِج EOU المنخفض في حوالي 24 ساعة بعد العدوى. كما يتضح من استنساخ A3667 ، وعزل B3858 ، كما أظهرت انخفاض EOU التعبير المروج ، في حوالي 24 ساعة بعد العدوى. ولكن زيادة عامة في التعبير المروج hctB، في حين أن عزل B3662، وأعرب عن زيادة مستويات من الفلورانس من المروج EOU تليها خسارة مفاجئة للتعبير في كلا المروجين.

تحليل ميكروجراف الخلية الحية لB3662 متحولة، ويكشف أن خلية المضيف تحلل حدث، في الخلايا المصابة بهذا متحولة، في وقت سابق بكثير مما كانت عليه في الخلايا المصابة من النوع البري. خلية نوع تطوير نقص استرداد الكلاميديا، قد لا يكون ممكنا، كما لا يمكن لهذه الخلايا إعادة دمج المضيف. ويمكن استخدام دراسات الارتباط واسعة الجينوم بعد العزل، لتحديد الجينات التنموية، من خلال الارتباط الإحصائي، مع دمج المراسلين المروجين البديل.

ويمكن توسيع هذه الطريقة، إلى التحقيق في العديد من المسارات الوراثية، في تشريح آليات الدوائر الوراثية، وغيرها من مسببات الأمراض داخل الخلايا.