طريقة الكشف الكمي عن microRNAs في الكلى لنموذج فأر إصابة الكلى الإقفارية

قد يكون التعبير المتغير عن الحمض النووي الريبي الصغير في AKI مفيدا للمؤشرات الحيوية والعلاج. هذا البروتوكول بسيط ويحقق نتائج ثابتة بين المختبرات. يمثل IRI للكلية أحد عوامل الخطر الرئيسية ل AKI. يؤدي القياس الكمي للحمض النووي الريبي الصغير الذي يتم تغييره بواسطة IRI إلى التشخيص. يتم تطبيق MicroRNAs المنقاة من عينة الكلى على نظام آخر. راقب بعناية انخفاض حرارة الجسم وترطيب الأمعاء وعمق التخدير طوال العملية. هذا بسبب وجود العديد من التقنيات اليدوية التي يجب التعود عليها.

[الراوي] بعد التأكد من عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم ، ضع الفأر المخدر على وسادة جراحية ساخنة في وضع الاستلقاء. بعد إجراء شق في البطن في خط الوسط ، استخدم قطعة قطن مبللة ب PBS لدفع الأمعاء برفق إلى الجانب الأيسر من تجويف البطن الإضافي لكشف الكلية اليمنى والحالب واستخدام ملقط بزاوية لرفع الحالب الأيمن. اربط الحالب في مكانين باستخدام 4-0 خيوط مضفرة من الحرير ، مع ترك أربطة أطول للخياطة الأقرب إلى الكلى ، وقطع بين الغرز. أمسك الخيط المتبقي بعناية ، وقم بتشريح النسيج الضام والدهون بصراحة على طول الكلى وتحديد الأوعية الدموية التي ليست الشرايين الكلوية أو الأوردة التي تزود الكلى اليمنى بالدم. اربط الوعاء الدموي ، وعندما يتم فصل الكلية اليمنى بشكل كاف ، قم بربط الوريد الكلوي والشراي. باستخدام قطعة قطن مبللة ب PBS ، ادفع الأمعاء برفق باتجاه الجانب الأيمن من تجويف البطن الإضافي لكشف الكلية اليسرى وتغطية الأمعاء بستارة مبللة. بعد تحضير الكلية اليسرى كما هو موضح ، قم بتثبيت الشريان الكلوي والوريد على بعد سنتيمتر واحد من الكلى للحث على إقفار الكلى اليسرى. يمكن تأكيد نقص التروية الناجح بصريا من خلال سواد تدريجي موحد لأنسجة الكلى. عند تأكيد نقص التروية ، أعد أنسجة الأمعاء إلى تجويف البطن ، مع الحرص على تجنب التواء الأمعاء ، وإغلاق جلد البطن مؤقتا ولفه. بعد 25 إلى 45 دقيقة ، قم بإزالة المشبك وتأكد من تحسن إعادة تروية تدفق الدم ولون الكلى. بعد التأكد من أن الأمعاء ليست ملتوية ، قم بغرس PBS داخل الصفاق وأغلق عضلة البطن والجلد في طبقتين باستخدام 4-0 خيوط نايلون. بعد 24 ساعة من تحريض الإصابة الإقفارية، أعد فتح شق خط الوسط واستخدم إبرة قياس 27 لجمع الدم من الوريد الأجوف السفلي. قم بعمل شق خط الوسط في جدار الصدر وأدخل إبرة قياس 23 في البطين الأيسر. بعد التأكد من التدفق العكسي في الإبرة ، قم بعمل شق في الفص الأيمن من الكبد وحقن 20 مل من PBS. سيتغير الكبد باللون الأحمر إلى الوردي ، مما يؤكد أنه تم تصريف كمية كافية من الدم. استخدم الملقط والمقص لإزالة الكلية اليسرى وغسل الأنسجة المستأصلة في طبق من PBS. ثم استخدم الملقط لإزالة اللفافة الكلوية دون تجفيف الكلى وقطع الكلى إلى نصفين على طول خط الوسط الرأسي. لتنقية الحمض النووي الريبي الميكرو ، ضع 30 ملليغراما من عينة الكلى المجمدة في خالط زجاجي يحتوي على 700 ميكرولتر من كاشف التحلل القائم على فينيل جوانيدين على الجليد وقم بلف المدقة ببطء وبشكل متكرر لتجانس العينة تماما. عندما يتم فصل الأنسجة تماما ، انقل المحللة المتجانسة إلى نظام تمزيق البوليمر الحيوي في عمود دوران جهاز طرد مركزي صغير في أنبوب تجميع سعة ملليلترين وجمع العينة إلى قاع الأنبوب عن طريق الطرد المركزي. انقل المحللة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد يحتوي على 140 ميكرولتر من الكلوروفورم واخلط الأنبوب عن طريق الانعكاس لمدة 15 ثانية مع شد الغطاء بإحكام. بعد حضانة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة ، قم بترسيب العينة عن طريق الطرد المركزي ونقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد يحتوي على 1.5 ضعف حجم الإيثانول بنسبة 100٪ دون إزعاج الحبيبات. امزج العينة لمدة خمس ثوان عن طريق الدوامة قبل نقل 700 ميكرولتر من العينة إلى عمود دوران قائم على غشاء السيليكا في أنبوب تجميع سعة ملليلتر. بعد عملية طرد مركزي قصيرة ، تخلص من التدفق واغسل العينة مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من محلول الغسيل 2 في عمود دوران جديد قائم على غشاء السيليكا لكل غسلة لإزالة أي آثار للملح. بعد الغسيل الثاني ، قم بالطرد المركزي لعمود الدوران القائم على غشاء السيليكا مرة أخرى ، وبعد التخلص من التدفق ، قم بنقل العمود إلى أنبوب تجميع جديد سعة 1.5 ملليلتر. أضف 25 ميكرولترا من الماء الخالي من RNase إلى العمود واحتضن العينة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل الطرد المركزي للعينة مرة أخرى. ثم انقل الإلويت المحتوي على microRNA سعة 25 ميكرولترا إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد. في هذه الدراسة ، تم التحقيق في سبعة microRNAs تم التعبير عنها في البشر التي تم تنظيمها في كلى الفئران المصابة بإصابة الكلى الحادة. تم العثور على مستويات ستة من الحمض النووي الريبي الصغير زادت بشكل كبير في الكلى من الفئران المصابة بإصابة نقص التروية مقارنة بتلك الموجودة في الفئران الوهمية التي تستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي كما هو موضح. كما تم تنظيم مستويات اليوريا والنيتروجين والكرياتينين في الدم في الدم والنخر الأنبوبي الحاد بشكل كبير.

لا تزال المؤشرات الحيوية لتشخيص IRI والعلاج المحدد ل AKI غير واضحة. آمل أن تتقدم أبحاث الحمض النووي الريبي الميكروي وتساهم في تشخيص وعلاج AKI.