قياس ارتباط النوكليوتيدات ببروتينات الغشاء الوظيفية السليمة في الوقت الفعلي
مارس 11, 2021
يقدم هذا البروتوكول طريقة لقياس ارتباط نيوكليوتيدات الأدينين بالمستقبلات في الوقت الفعلي في بيئة خلوية. يتم قياس الارتباط على أنه نقل طاقة الرنين Förster (FRET) بين مشتقات نيوكليوتيدات ثلاثي نيتروفينيل والبروتين المسمى بحمض أميني فلوري غير قانوني.
وبما أن جزيء ATP رسول خلوي مهم، فقد طورنا طريقة تسمح لنا بقياس ارتباط جزيء ATP بمستقبلاته بدقة عالية. باستخدام FRET بين مشتقات النوكليوتيدات والبروتينات الموسومة بالفلورسنت ، يمكننا مراقبة ارتباط النوكليوتيدات بالمستقبلات الوظيفية السليمة في الوقت الفعلي وبدقة مكانية ممتازة. نستخدم هذه الطريقة لفهم آثار التمثيل الغذائي الخلوي على قناة البوتاسيوم الحساسة ATP ، والتي تشارك في أشكال معينة من مرض السكري.
لإعداد تجربة غشاء غير مسقوف ، استخدم أولا زوجا من الملقط لكسر جزء صغير من زلة غطاء بخلايا منقولة وشطف الجزء باستخدام برنامج تلفزيوني. إذا كانت زلة الغطاء مغلفة مسبقا بالبولي ليسين ، فضع الجزء في قاع طبق 35 ملم يحتوي على ملليلتر من PBS وأمسك صوتي مسبار ثلاثة ملليمترات من ثلاثة إلى خمسة ملليمترات فوق العينة ، ينبض عند 50 واط وسعة 20 إلى 40٪ لمدة 200 إلى 500 مللي ثانية لفتح الخلايا. إذا لم تكن زلات الغطاء مغلفة مسبقا ، بعد الشطف باستخدام PBS ، اغمس الجزء في أنبوب يحتوي على 0.1٪ poly-L-lysine لمدة 30 ثانية تقريبا قبل فتح الخلايا بصوتنة قصيرة كما هو موضح.
نقل جزء صوتنة إلى الزجاج المغطى أسفل 35 ملم طبق يحتوي على ملليلتر من محلول حمام وتركيب الطبق على المجهر المقلوب مجهزة بفتحة عددية عالية 60x هدف الغمر في الماء. تأكد من أن منفذ الكاميرا الخاص بالمجهر متصل بمطياف في سلسلة بكاميرا CCD عالية الحساسية واستخدم مضخة تمعجية لتغذية غرفة الحمام بمخزن مؤقت بمعدل تدفق يتراوح من 0.5 إلى ملليلتر واحد من المخزن المؤقت في الدقيقة. لتحديد شظايا الغشاء غير المسقوفة التي تعبر عن القناة المصنفة ANAP ، اعرض العينة لتحديد موقع الأغشية ذات القنوات الفلورية.
قم بإشراك قناع مقياس الطيف جزئيا بين منفذ الكاميرا على المجهر والمطياف. سيظهر ظل القناع على صورة الكاميرا. الحصول على حقل مشرق وصورة مضان للغشاء غير المسقوف للسماح باختيار المنطقة محل الاهتمام للتحليل.
اجعل طرف نظام التروية microvolume قريبا من الغشاء غير المسقوف. للحصول على صورة لمضان ANAP ، قم بإثارة الغشاء باستخدام مصباح LED 385 نانومتر من خلال مرشح إثارة تمرير نطاق 390/18 نانومتر وحافة ثنائية اللون 416 نانومتر ، وجمع الضوء المنبعث من خلال مرشح انبعاث طويل 400 نانومتر. قم بإشراك قناع مقياس الطيف وتأكد من مرور الضوء المنبعث.
قم بمحاذاة المنطقة محل الاهتمام مع شق قناع مقياس الطيف. إشراك حواجز شبكية الطيف. مع وجود حواجز شبكية في مكانها ، سيتم إسقاط الضوء المنحرف بواسطة مقياس الطيف على شريحة كاميرا CCD لإنتاج صور طيفية.
ستحتفظ الصور بالمعلومات المكانية في البعد Y. سيتم استبدال البعد X بالطول الموجي. أثناء الترشيح باستخدام محلول عازل خال من النوكليوتيدات ، احصل على واحد أو أكثر من التعرض من 0.1 إلى 10 ثوان لتصحيح المصب وتطبيع البيانات التي تم جمعها خلال بقية التجربة.
بعد ذلك ، قم بتطبيق مجموعة من تركيزات TNP ATP في محلول الاستحمام لإنشاء منحنى استجابة التركيز ، مع تعطير كل محلول لمدة دقيقة واحدة على الأقل لضمان الوصول إلى حالة مستقرة والحصول على تعرض لكل تركيز. بعد كل تركيز ، اغسل TNP ATP بمحلول حمام خال من النوكليوتيدات لمدة دقيقة واحدة على الأقل قبل الحصول على صورة التعرض بعد العلاج. لإجراء تجربة قياس الفلور بمشبك رقعة ، قم أولا بسحب ماصات التصحيح من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات ذات الجدران السميكة إلى مقاومة من 1.5 إلى 2.5 ميجاأوم عند ملئها بمحلول ماصة.
بعد ذلك ، قم بنقل زلة غطاء مع خلايا منقولة إلى طبق زجاجي 35 ملم يحتوي على ملليلتر من محلول الاستحمام وقم بتركيب الطبق على المجهر المقلوب. قم بتهوية غرفة الاستحمام بمحلول الاستحمام وحدد خلية تعبر عن القنوات المصنفة ANAP. ضع ضغطا إيجابيا لطيفا على ماصة التصحيح وضع الماصة في حجرة الاستحمام.
اضغط على الماصة على غشاء الخلية وقم بتطبيق شفط لطيف لتحقيق ختم جيجاأوم. لاستئصال الرقعة ، حرك حامل الماصة بسرعة بعيدا عن الخلية المرقعة. اجعل طرف ماصة الرقعة بالقرب من طرف نظام التروية ، وتحقق من أن الرقعة داخل شق قناع مقياس الطيف.
ثم قم بتطبيق TNP ATP وجمع أطياف الصور. في هذه الصور ، يمكن ملاحظة جزء غشاء نموذجي غير مسقوف من خلية HEK293T يعبر عن قنوات البوتاسيوم الحساسة ل ATP الموسومة ببروتين الفلورسنت البرتقالي. في هذه الصورة الطيفية لقنوات البوتاسيوم الحساسة ل ANAP الموسومة ATP في غشاء غير مسقوف من خلية HEK293T معرضة لخمسة ميكرومولار TNP ATP ، يمكن ملاحظة منطقتين من الكثافة العالية التي تتوافق مع ذروة انبعاث ANAP و TNP ATP.
يمكن الحصول على طيف نهائي عن طريق طرح متوسط طيف الخلفية من متوسط طيف منطقة الاهتمام. هنا ، يمكن ملاحظة الانخفاض في ذروة مضان ANAP بعد التعرض المتعدد. تم تركيب ذروة التألق من عدة تعرضات في غياب TNP ATP على اضمحلال أسي واحد.
ثم تم استخدام هذه البيانات لتصحيح القطع الأثرية للتبييض الضوئي. هنا ، يتم عرض صور طيفية تمثيلية من غشاء غير مسقوف تم الحصول عليه من خلية تعبر عن ANAP الموسومة بقنوات البوتاسيوم الحساسة ل ATP في غياب ووجود TNP ATP. تكشف مراقبة أطياف الانبعاثات المصححة عن فصل واضح بين انبعاث الفلورسنت المانح والمتلقي.
في هذا الشكل ، يتم عرض التيارات والأطياف التمثيلية من ANAP الموسومة بقنوات البوتاسيوم الحساسة ل ATP من تجربة قياس فلوري نموذجية بمشبك رقعة. يتم تصحيح أطياف الانبعاث للخلفية والتبييض كما هو موضح للأغشية غير المسقوفة. توخ الحذر من عناصر التحكم للتحقق من أن إشارة الفلورسنت خاصة بالمستقبل.
تأكد من أن وفرة الخاصة بك سريعة وفعالة وكاملة والحفاظ على التعرض الخاص بك قصيرة قدر الإمكان. تجيب هذه الطريقة على أسئلة حول إشغال المستقبلات وكيفية ارتباطها بالوظيفة. يمكن لتقنيات FRET الأخرى المستخدمة مع إعداد مماثل أن تسبر التغييرات التأكيدية التي يسببها الرباط في المستقبل.
النظرة العامة
يعرض هذا البروتوكول طريقة لقياس ارتباط نوكليوتيدات الأدينين بالمستقبلات في الوقت الحقيقي في بيئة خلوية. باستخدام نقل طاقة رنين فورستر (FRET) بين مشتقات النوكليوتيدات والبروتينات الموسومة بالفلورسنت، يمكن للباحثين مراقبة ارتباط النوكليوتيدات بالمستقبلات الوظيفية بدقة عالية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- الفيزياء الحيوية
الخلفية
- ATP هو رسول خلوي مهم مشارك في مسارات الإشارات المختلفة.
- فهم ارتباط ATP بمستقبلاته ضروري لدراسة التمثيل الغذائي الخلوي.
- القناة الحساسة لـ ATP والبوتاسيوم متورطة في أشكال معينة من مرض السكري.
- تقنيات القياس في الوقت الحقيقي تعزز فهم ديناميات المستقبلات.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة لقياس ارتباط ATP بالمستقبلات في الوقت الحقيقي.
- التحقيق في تأثيرات التمثيل الغذائي الخلوي على القنوات الحساسة لـ ATP والبوتاسيوم.
- توفير بروتوكول مفصل لإجراء التجارب في بيئة خلوية.
الطرق المستخدمة
- قياس FRET باستخدام مشتقات نوكليوتيدات ثلاثي نتروفينيل.
- إزالة السقف من شظايا الغشاء من الخلايا المحقونة.
- استخدام التصوير المجهري ذو الفتحة الرقمية العالية للتصوير.
- قياس التدفق الخلوي لتحليل نشاط المستقبلات.
النتائج الرئيسية
- قياس ناجح لديناميات ارتباط ATP في الوقت الحقيقي.
- تحديد شظايا الغشاء المكشوفة التي تعبر عن القنوات الموسومة بالفلورسنت.
- إنشاء منحنيات استجابة التركيز لـ TNP ATP.
- ملاحظة الفصل الواضح بين الانبعاثات الفلورسنتية للمانح والمتلقي.
الاستنتاجات
- تسمح الطريقة المطورة بمراقبة دقيقة لتفاعلات مستقبلات ATP.
- تساهم النتائج في فهم دور ATP في التمثيل الغذائي الخلوي.
- يمكن تطبيق هذا البروتوكول في مزيد من الدراسات حول ديناميات المستقبلات ووظيفتها.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This method enables real-time quantification of nucleotide binding to functional membrane proteins, providing mechanistic insights into ligand-dependent gating that can inform target validation for nucleotide-regulated receptors. By integrating binding measurements with functional readouts such as ion channel current, it supports de-risking of therapeutic hypotheses in discovery programs targeting metabolic and neurological disorders. The approach is adaptable to other receptors with suitable fluorescent ligands, offering a reusable platform for assay development and screening readiness.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures real-time occupancy of nucleotide-binding sites on intact, functional receptors to interrogate therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Enables direct correlation of ligand binding with protein function via simultaneous current measurement in excised patches.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by resolving ligand-dependent gating dynamics of targets like KATP channels.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative concentration-response curves using TNP ATP derivatives to establish binding affinity and potency.
- Reproducibility: Uses standardized unroofed membrane and patch-clamp fluorometry setups to minimize variability across experiments.
- Scalability: Compatible with high-resolution imaging and spectral analysis for multi-condition testing.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to ATP-sensitive potassium channels implicated in certain forms of diabetes, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges binding kinetics to functional outcomes, enabling risk-adjusted advancement decisions.
- Mechanistic Insight: Reveals how nucleotide binding modulates channel activity, informing structure-function relationships in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation by providing binding-function correlation data.
- Discovery Biology: Tests target engagement and pathway modulation by measuring nucleotide binding in native-like membrane environments.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible binding data suitable for hit confirmation and SAR development.
- Analytics: Produces corrected emission spectra and binding isotherms that enable comparison of ligand efficacy and potency.
- Translational Research: Links binding events to functional readouts in disease-relevant systems such as metabolically active cells.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other nucleotide-regulated proteins or receptors with compatible fluorescent ligands, supporting platform-level investment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic clarity on ligand-receptor interactions, reducing ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes real-time binding measurements with spatial and temporal resolution in intact membranes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by confirming target engagement with functional correlation.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of compounds based on binding kinetics and functional impact.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular tagging with non-canonical amino acids like ANAP and FRET-based detection.
- Depends on instrumentation including spectrograph-equipped microscopes, high-sensitivity CCD cameras, and microvolume perfusion systems.
- Necessitates standardization of membrane preparation (unroofed or excised patches) and buffer conditions across teams.
- Adaptation to other systems requires identification of suitable fluorescent nucleotide derivatives and compatible protein tags.
- Potential limitations include photobleaching artifacts and the need for careful controls to ensure signal specificity, as noted in the data treatment section.
