قرب متزامنة ليزر المسح Confocal والقوة الذرية المجهرية (Conpokal) على الخلايا الحية

يجمع Conpokal بين المجهر النقّي المجهري مع المجهر باستخدام مسبار لكزة سطح العينة. على الرغم من أن كلا التقنيات فعالة بشكل فردي، Conpokal يسهل التوطين المفلور مع التوصيف الميكانيكي. الميزة الرئيسية لتقنية كونكوكلال، هي المجهر المزدوج المتزامن القريب.

تحقق Confocal في العمليات الخلوية قبل وبعد فحص AFM، والتي توفر خصائص ميكانيكية خاصة بالمنطقة. هذه التقنية هي مؤثرة داخل مجال علم الأحياء الميكانيكية على سبيل المثال ، يمكن فحص خلايا الدماغ في ظل ظروف فسيولوجية لفحص النبضات الكهربائية والمعاملة بالقوة. قبل البدء في التحليل، حدد afm cantilever المناسبة لجمع البيانات المطلوبة واستخدام القفازات، وشريحة AFM مرحلة التركيب، والملاقط، ومفك صغير لتركيب رقاقة في كتلة الزجاج.

ضع رقاقة AFM بعناية على مركز الكتلة الزجاجية. وينبغي أن تكون كانتليفر بالإضافة إلى جزء صغير جدا من رقاقة AFM في الجزء المرئي وغير معتم من كتلة الزجاج. استخدام مفك لتشد المسمار حتى رقاقة دافئ ضد كتلة الزجاج، واستخدام عدسة للتحقق من أن يتم توجيه رقاقة بشكل صحيح.

عندما تم توجيه رقاقة بشكل صحيح، ووضع كتلة الزجاج في رأس AFM في الاتجاه السليم وقفل كتلة الزجاج في مكان. بعد تحديد الجزء السفلي من طبق المعايرة عن طريق المجهر حقل مشرق، واستخدام نظام AFM Z stepper لوحة التحكم في المحركات لتحريك afm cantilever 2000 ميكرون فوق العينة. باستخدام الإضاءة الميدانية الساطعة ولوحة التحكم بمحركات Z stepper ، قم بخفض رقاقة AFM ببطء إلى الجزء السفلي من الطبق الزجاجي بخطوات من 100 إلى 200 ميكرون لتجنب تحطم طرف AFM في طبق بيتري.

حدد موقع ميكرومترات يدوية التي تتحكم X Y أو في حركة عادية من رئيس AFM على منصة الصك. كما الظل من afm cantilever يصبح أغمق، وشكل يصبح أكثر وضوحا، واستخدام ميكرومترات يدوية لتصحيح رئيس AFM وضبط موقف cantilever AFM ضمن مجال الرؤية. في هذا الوقت، قد تحتاج جداول البحث إلى ضبط.

مشاهدة لظل لتظهر في عرض برنامج المجهر، مما يشير إلى أن تلميح AFM هو الاقتراب من الجزء السفلي من الطبق. استمر في استخدام الخطوات الصغيرة لخفض طرف AFM حتى يكون الطرف في الغالب في التركيز. عندما يكون الليزر في موضعه، استخدم محاذاة الليزر لوضع الليزر على الجانب الخلفي من حيث يقع طرف AFM على الـ cantilever.

يجب أن تعرض لوحة محاذاة الليزر إشارة مجموع أكبر من فولت صفر. حرك الليزر، وهي مسافة صغيرة في جميع الاتجاهات على afm cantilever، حتى يتم تحقيق أقصى إشارة المبلغ أثناء البقاء في طرف AFM. بمجرد تعيين موضع الليزر، استخدم طلب الانحراف الذي يتم التحكم فيه يدويًا إلى صفر الانحراف الرأسي والاتني.

استخدم مقابض الانحراف العمودية واللمائية لمحاذاة الكاشف بحيث يكون الهدف مركزًا ولا يوجد انحراف عمودي أو أفقي ملحوظ في لوحة محاذاة الليزر. افتح نافذة المعايرة، وأدخل كافة المعلومات الخاصة بالتجارب. استبدل فلتر ضوء الليزر.

قبل المعايرة، قم بإيقاف مصدر ضوء المجهر confocal وإغلاق الضميمة AFM لإخماد أي ضوضاء محتملة قادمة من ضوء الغرفة أو الاهتزازات. اضغط على الزر المعايرة للسماح تلقائياً للنظام بمعايرة الطرف. عند اكتمال المعايرة، سيتم عرض صلابة الـ cantilever وحساسيتها في لوحة المعايرة.

ثم استخدم زر الأوامر التلقائية للنهج لخفض الطرف إلى الجزء السفلي من طبق العينة وتعيين حجم منطقة الجلد، والقرار، نقطة تعيين، وطول Z، ووقت بكسل، قبل الضغط على زر التشغيل لبدء المسح الضوئي. للتصوير المجهر confocal في برنامج المجهر، تمكين قدرات confocal واختيار خطوط الليزر المناسبة للصبغات التي استخدمت لتلوين العينات. حدد واحد أو خطوط ليزر متعددة لإثارة وصورة تلك الميزات في العينة وتعيين كسب إلى قيمة يحسن الفلوريسنس العينة ولكن يحد من كمية الضوضاء.

اضبط قوة الليزر لتجنب البيكسلات المشبعة مع زيادة النطاق الديناميكي إلى أقصى حد وتعيين حجم الثقب على وحدة منطقة واحدة لزيادة الدقة للقطع البصري. إذا لزم الأمر، قم بضبط القيم استنادًا إلى سطوع العينة. لتعيين وقت البكسل، ابدأ بوقت سكن ميكروثاني، واضبط لتعكس سطوع العينة حسب الحاجة.

لتحديد حجم البيكسل للهدف المحدد، دع الأداة تحسب حجم البيكسل عبر زر خيار Nyquist والعدد المحدد من البيكسلات في الصورة. بعد ذلك، حدد الخيار المسح الضوئي وبدء جمع البيانات. استخدم مقبض التركيز لتحديد موقع الطائرة البؤرية التي تمثل ميزات العينات في أوضح صورها ، وزر Scan لبدء جمع البيانات ، وزر الالتقاط لالتقاط صورة ثنائية الأبعاد.

باستخدام اللوحة التي تتحكم في حجم البكسل عبر خيار Nyquist، قم بتقليل حجم المساحة للمسح الضوئي لتغلف خلية واحدة فقط. قم بتنشيط أداة التجميع واستخدام خيار من الأسفل إلى الأعلى، مع خط الليزر الذي يضيء ميزة في العينة بشكل أوضح، قم بتعيين مستويات البداية والنهاية لوحدة التخزين التي سيتم قياسها باستخدام التباعد المقترح بين الأحجام. اسم الملف وحفظه إلى المجلد المقترن.

بدلا من ذلك، إذا لدينا معرفة مسبقة من سمك العينات موجود، حدد ألمع، حاد، الطائرة الوسطى عن طريق ضبط التركيز لتحديد حجم وتعيين أعلى أن يكون سمك العينة فوق المستوى الأوسط، وأسفل أن يكون سمك تحت المستوى الأوسط، ثم حدد حجم الخطوة المناسبة. تشغيل عملية الاكتساب عن طريق الضغط على زر تشغيل الآن. عند انتهاء عملية الامتلاك، احفظ الملف في المجلد المناسب.

في نهاية التجربة، وارتداء القفازات أثناء إزالة كتلة الزجاج ووضعها في محطة تركيب. استخدام ملاقط مع قبضة المطاط لإزالة بعناية رقاقة AFM ووضع الطرف المستخدم مرة أخرى إلى موقع مربع التخزين الموجهة قبالة الوصول إلى الإشارة إلى أنه قد تم استخدامها. بالنسبة للرجوع إليها في المستقبل، لاحظ أي طرف تم استخدامه في التجربة.

هنا، يتم عرض مسح AFM ممثل على خلية HEK حية. كان ارتفاع هذه الخلية HEK خاصة حوالي 10 ميكرون كما يتضح من مسح الخط. هنا ، يمكن ملاحظة مثال على الفحص الضعيف بسبب اختيار تلميح AFM غير لائق.

في هذه الصورة، ظهرت بيكسلات سوداء في قمة الخلية تشير إلى أن منطقة AFM PA كانت خارج النطاق بسبب ارتفاع الخلايا الكبيرة. نهاية كانتليف AFM يظهر أيضا في الصورة بسبب إزاحة الطرف جنبا إلى جنب مع ارتفاع تلميح غير كافية بالمقارنة مع ارتفاع الخلية. هذه القطع الأثرية في صورة AFM، تشير إلى أنه كان ينبغي اختيار تلميح AFM مختلف لتصوير الخلية.

ويمكن إجراء ثلاثة صور ملونة. على سبيل المثال، لتصور نواة الخلية، الأنابيب الصغيرة، والغشاء الدهني. تحليل المسافات البادئة تلميح في تركيبة مع نموذج نانو الميكانيكية، ويسمح لتوليد خريطة معامل من السطح.

هنا، يتم عرض 3D المقابلة من كومة بالليزر confocal Z. كما يمكن الحصول على مسح AFM وخرائط المعامل المقاسة للميكروبات ، كما لوحظ في هذه التحليلات التمثيلية للمكاكر العقدية المتطاولة الجرثومة. كما هو موضح، يمكن تحقيق حل أفضل على هذا النطاق مع AFM، من مع المجهر confocal التقليدية.

رسم خرائط قوة لاصقة هي تقنية يتم تنفيذها من خلال conpokal لتصور التفاعلات الجزيئية. على سبيل المثال، لدراسة تعديل جزيئات سطح الخلية لمراقبة حركية الربط. Conpokal يبشر في مسار جديد لاستكشاف هيكل العلاقات وظيفة في علم الأحياء المجهرية الطبية.

على سبيل المثال، يمكن ربط الأحداث الفيزيائية والكيميائية وطبقة بيبيدوغليكان، إلى مقاومة المضادات الحيوية.