تحسين UPLC-UV طريقة ل الكم من فيتامين (ج) في أصناف الخس(Lactuca sativa L.) والمحاصيل البرية الأقارب(Lactuca spp.)

فيتامين C هو مؤشر على القيمة الغذائية للفواكه والخضروات. نحن بحاجة إلى طريقة سهلة وموثوق بها لتحديدها كميا، وخاصة في الخس، والخضروات الورقية الأكثر استهلاكا في جميع أنحاء العالم. هذه الطريقة تمنع تدهور فيتامين C، وتوفر استخراج محسنة وسرعة، وتحديد كمي موثوق به لكل من الأحماض الاسكوربيك وdehydroascorbic، وذلك بفضل دقة وحساسية.

ويمكن استخدام هذه الطريقة في تكنولوجيا الأغذية لخلق علامات الواقع الغذائية، في الطب لدراسة الآثار الغذائية على الصحة وتربية النباتات، لزيادة محتوى فيتامين (ج) في أنواع مختلفة. مما يدل على الإجراء مع إينيس مدينا لوزانو، سيكون خوسيه أنخيل أرانخويلو وأرانتزازو كاستيانوس، وهما محللان من مختبري. لإعداد عينات النبات، حصاد واحد على الأقل الخارجي وورقة داخلية واحدة لكل مصنع وتجميد الأوراق فورا في النيتروجين السائل، قبل وضعها في تخزين ناقص 80 درجة مئوية.

لlyophilize عينات النباتات المجمدة، ووضع أنابيب العينة غير المغطاة على الصواني داخل غرفة مجفف تجميد من مزيل الجفاف، وبرنامج مزيل lyophil كما هو مبين. الحفاظ على درجة حرارة المكثف في ناقص 80.2 درجة مئوية، وثابت فراغ في 112 عندما تكون المادة جافة تماما، إضافة 10 ملليمتر كرات الفولاذ المقاوم للصدأ القطر إلى عينات مزيل، في أنابيب البولي بروبلين 20 ملليلتر. واستخدام دوامة متعددة الأنابيب، في الوقت المناسب وكثافة، لطحن العينات في الغبار الناعم.

لإعداد الأسهم القياسية حمض الاسكوربيك وحلول التخفيف، تزن بالضبط 10 ملليغرام من معيار حمض الاسكوربيك على توازن الدقة. وعند 90 ملليلتر من المرحلة المتنقلة للعينة. استخدم جهاز ستيرلر المغناطيسي لإذابة العينة، واستخدم قارورة حجمية لقياس 100 ملليلتر بدقة من الحل الناتج.

إضافة إضافية فائقة الpure المياه، حموضة في درجة الحموضة اثنين مع حمض فليك، حسب الضرورة. ثم إعداد خمسة تخفيفات من المخزون، للحصول على منحنى المعايرة. العمل تحت كثافة الضوء المنخفض، إضافة 50 ملليغرام من العينة الأرض الlyophilized وخمسة ملليلتر من المذيبات استخراج، إلى أنبوب الطرد المركزي البولي بروبلين 15 ملليلتر ودوامة الحل لمدة خمس ثوان.

بعد هز العينة لمدة 10 دقائق على شاكر المدارية في 2000 الثورات في الدقيقة الواحدة، ونقل الأنبوب إلى حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق، في درجة حرارة الغرفة وجمع العينة عن طريق الطرد المركزي. ثم سلالة supernatant من خلال 0.22 ميكرون تجديد مرشح السليلوز، في قارورة العنبر خمسة ملليلتر، لاستخراج كل من الأحماض الاسكوربيك وdehydroascorbic في استخراج واحد. لإعداد التخفيف لتحديد تركيز حمض الاسكوربيك في عينات الأوراق، إضافة 200 ميكرولترات من استخراج واحد، و 800 ميكرولترات من الماء فائقة الخطورة في قارورة كروماتوغرافيا سائلة من نوع العنبر مليلتر، وإغلاق القارورة بمكونات PTFE/السيليكون.

بالنسبة لاستخراج حمض الاسكوربيك الكلي، قم بنقل 200 ميكرولترات من استخراج واحد، إلى قارورة كروماتوغرافيا سائلة من نوع ملليلتر، وإضافة 200 ميكرولترات من محلول الحد من القارورة. أغلق القارورة مع المكونات ودوامة الحل لمدة خمس ثوان. بعد حضانة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء، واستخدام 200 ميكرولترات من 0.4 حمض الكبريتيك المولر، لوقف التفاعل وتثبيت حمض الاسكوربيك، إلى درجة الحموضة الحمضية.

لإعداد التخفيف لتحديد مجموع تركيز حمض الاسكوربيك في العينات، إضافة 400 ميكرولترات من الماء فائقة التبخر، إلى مجموع استخراج حمض الاسكوربيك اثنين. أغلق القارورة بمكونات. قبل ساعة واحدة على الأقل من بدء التجربة، تأكد من أن جميع الحلول العاملة قد تم تحميلها في نظام UPLC والتبديل على الوحدات النمطية UPLC الثلاثة.

عند انتهاء عملية المعايرة الداخلية، افتح البرنامج وحمّل البرنامج الفعال. مرة واحدة يتم تحميل البرنامج انقر فوق مدير المذيبات الرباعية وانقر فوق زر الماوس الأيمن لتحديد وحدة التحكم في التشغيل، للوصول إلى وحدة التحكم إدارة UPLC. انقر فوق النظام، والتحكم وبدء التشغيل، للشروع في إعداد وتثبيت صك UPLC، وانقر فوق مذيبات رئيس الوزراء، QSM، والتحقق من A، B، C، D، غسل الختم ومدة رئيس الوزراء، أكبر من خمس دقائق، لتطهير جميع خطوط UPLC، لمدة خمس دقائق على الأقل.

انقر فوق SM، والتحقق من غسل المذيبات أكبر من 45 ثانية. تحقق من المذيبات التطهير، و 35 دورات لتطهير وتنظيف حاقن. لتكبيل UPLC إلى شروط الأسلوب، تحقق من اكويبيرات إلى الأسلوب و QSM، وتعيين التدفق إلى 0.3 ملليلتر في الدقيقة.

المذيب A إلى 2٪ المذيب B إلى 0٪ المذيب C 98٪ والمذيب D إلى 0٪ لا يزال في اكوسيبرات إلى الأسلوب وSM وتعيين العينة إلى 5 درجات مئوية، والعمود إلى 30 درجة مئوية. لا يزال في اكوريبراتي إلى أسلوب وأخرى، حدد مصباح تشغيل، وانقر فوق ابدأ. السماح للمعدات بالستقر لمدة ساعة على الأقل.

للتحقق من الاستقرار، انقر فوق تشغيل نظام وحدة التحكم و QSM وحدد ضغط نظام QSM، فقط للتحقق من الضغط في العمود. إذا لم تكن هناك اتجاهات محددة في التغييرات الضغط، وقيمة دلتا هو أقل من 10 جنيه لكل بوصة مربعة من الضغط، في شاشة البداية السريعة، وملء المصفوفة مع أسماء المعايير والعينات التي سيتم تحليلها. لتحديد تركيز حمض الاسكوربيك في المعايير، حقن خمسة ميكرولترات من كل تخفيف في صك UPLC، وتنفيذ الكروماتوغرافيا، بدءا من معظم المخفف، إلى الحل الأكثر تركيزا كما هو مبين في الجدول.

لتحديد حمض الاسكوربيك وتركيز حمض الاسكوربيك الكلي في عينات الأوراق، يحقن خمسة ميكرولترات من المصطف المخفف ويستخرج اثنين على التوالي، في أداة UPLC لتحليل الكروماتوغرافيا. لحساب حمض الاسكوربيك ومجموع تركيزات حمض الاسكوربيك، في البرنامج انقر فوق Quickstart، تصفح المشروع، القنوات، اسم معيار أو عينة وقناة المساعد الشخصي الرقمي واحد، 245 نانومتر في 1.2 نانومتر. لفتح الكروماتوجرامات القياسية وعينة، انقر على نقطة البداية من الكروماتوغرام واسحبه إلى نقطة النهاية، لدمج الذروة المقابلة في المعايير والعينات.

ثم استخدام البيانات من التخفيفات القياسية حمض الاسكوربيك، لبناء منحنى المعايرة، لتمثيل قيم امتصاص الكروماتوغرافيا المحددة واستيفاء قيم الامتصاص من العينة، للحصول على حمض الاسكوربيك وتركيز حمض الاسكوربيك الكلي، وفقا للصيغة. فيتامين C الكم في مصفوفات Lactuca، يتطلب تطوير نهج الكروماتوغرافي التي يمكن أن تضمن نتائج موثوقة. هنا، يمكن ملاحظة الكروماتوغرام الناتجة عن بروتوكول غير محسن تقديم وذروة حمض الاسكوربيك، جنبا إلى جنب مع مجهول الهوية في الكتف عامل منجم.

ومع ذلك، بعد تحسين ظروف الاستخراج والكروماتوغرافية، يمكن التوصل إلى حل ذروة حمض الاسكوربيك دون تداخل المركبات غير معروف. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام معدات الأشعة فوق البنفسجية UPLC، بدلاً من الأشعة فوق البنفسجية HPLC، يقلل من زمن الاستبقاء والجري. التدخلات في قمم حمض الاسكوربيك، يؤدي باستمرار إلى التقليل من محتوى فيتامين C، وذلك بسبب عدم كفاية الفصل أثناء عملية الكروماتوغرافي.

كما يتم دمج مناطق الذروة المتداخلة من قبل انخفاض عمودي في أعمق نقطة بينهما. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام بروتوكول غير الأمثل يمنع استخلاص أي استنتاج مفيد، من النتائج. كما يبدو أن جميع العينات لها محتوى فيتامين C مماثلة, في أي من أشكاله.

وفي المقابل، يتيح استخدام البروتوكول الأمثل الكشف عن الاختلافات ذات الأهمية الإحصائية بين الأنواع المختلفة من العينات. تأكد من جمع عينات متعددة، للحفاظ على العينات بشكل صحيح، لتقليل تعرض العينة لعوامل المؤكد، وتحديد كلا الشكلين من فيتامين C.The إجمالي محتوى فيتامين C يمكن أن يكون كميا ليس فقط في أي نوع من النباتات ولكن أيضا، في أي فاكهة في أي من الفواكه والخضروات، أو حتى الأغذية المصنعة مع تعديلات تقنية قليلة.