التمايز وتوصيف السلف العصبية والخلايا العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس

بالإضافة إلى بروتوكول تمايز الخلايا الجذعية الجنينية للفأر إلى خلايا عصبية ، نعرض أيضا مجموعة من التجارب التي يمكنها تحليل عملية التمايز بشكل شامل. هذه التقنيات ذات صلة بالتطور الجنيني المبكر للأديم الظاهر ، مما يوفر للباحثين خيارات لتحليل تمايز الخلايا العصبية. عند محاولة هذا الإجراء ، من الضروري البدء بالخلايا الجذعية في الحالة المثلى.

ومن ثم فمن المهم أن يتم استزراع EBs و MPCs والخلايا العصبية في وسائط جديدة ومثالية. يعد العرض المرئي لهذا البروتوكول أمرا مهما ، لأنه يحتوي على تفاصيل دقيقة يمكن أن تؤثر على نجاحه وفعاليته ، وخاصة جزء التمايز. ابدأ بإعداد ثقافة الخلايا المتساقطة المعلقة.

بالنسبة للوحة زراعة الخلايا التي يبلغ طولها 10 سم ، اضبط التركيز على 500 خلية لكل 20 ميكرولترا من وسط التمايز. قم بإعداد تعليق خلوي كاف ل 50 قطرة سعة 20 ميكرولتر. استخدم ماصة دقيقة أو ماصة مكررة لوضع قطرات سعة 20 ميكرولترا من تعليق الخلايا على غطاء لوحة زراعة الأنسجة، مع التأكد من أن القطرات ليست قريبة جدا من بعضها البعض، لمنعها من الاندماج.

املأ الطبق بخمسة إلى 10 مل من PBS وأعد الغطاء بعناية إلى اللوحة. احتضان الثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية. بعد يومين ، اجمع القطرات من الغطاء ، وضعها في لوحة تعليق لثقافة الخلايا بطول 10 سم مملوءة ب 10 ملليلتر من وسط التمايز ، ثم ضع اللوحة على شاكر مداري مضبوطة على سرعة منخفضة في الحاضنة.

بعد يومين آخرين ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 200 مرة G لمدة ثلاث دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية. للحث على تمايز الجسم الجنيني إلى خلايا سلفة عصبية ، أعد تعليق الخلايا في وسط التمايز بحمض الريتينويك بخمسة ميكرومولار. احتضن اللوحة لمدة يومين ، ثم استبدل النصف الأدنى من الوسط بوسط جديد ، عن طريق إمالة اللوحة وإخراجها للخارج.

اجمع الخلايا بعد يومين عن طريق الطرد المركزي لها عند 200 مرة G لمدة ثلاث دقائق ، وإزالة المادة الطافية. قم بإصلاح الأجسام الجنينية والخلايا السلفية العصبية باستخدام 4٪ PFA في PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإزالة PFA واغسل الخلايا في PBS لمدة خمس دقائق.

احتضان الخلايا بشكل متسلسل في محاليل السكروز PBS 10 و 20 و 30٪ ، عند 25 إلى 28 درجة مئوية ، مع كل حضانة تستمر 30 دقيقة أو أكثر حتى تستقر الخلايا في قاع الأنبوب. واستخدمه لنقل العينة إلى مركز Cryomold ، وإخراج السائل الزائد. أضف بعناية درجة حرارة القطع المثلى أو محلول OCT إلى القالب ، دون إعادة تعليق العينة ، ثم قم بإزالة الفقاعات الزائدة باستخدام ماصة.

ضع القالب مع العينة على خلاط مختبري بسرعة منخفضة لمدة 15 دقيقة ، مما يؤدي إلى تسوية الأجسام الجنينية والخلايا السلفية العصبية في قاع محلول OCT. ثم قم بتجميد العينة بسرعة عن طريق وضع القالب في النيتروجين السائل. قم بحظر أقسام OCT أو غرف الثقافة التي تحتوي على خلايا عصبية في مصل الحمير العادي بنسبة 10٪ ، و 0.1٪ Triton X-100 في PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

ثم احتضان العينات في الجسم المضاد الأولي ، المخفف في مصل الحمير العادي بنسبة 5٪ ، و 0.05٪ Triton X-100 في PBS ، عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، اغسل العينات في PBS باستخدام 0.1٪ Triton X-100 ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل غسلة. احتضنها بجسم مضاد ثانوي ، مخفف في مصل الحمير العادي بنسبة 5٪ ، و 0.05٪ Triton X-100 في PBS ، لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

كرر عمليات الغسيل في Triton X-100 و PBS ، ثم احتضن العينة في ميكروغرام واحد لكل مليلتر DAPI. قم بتركيب العينة بزلة غطاء وبعض وسائط التثبيت ، واتركها تجف ، وقم بتصويرها بمجهر فلوري. لإجراء تمايز الخلايا العصبية ، تمت زراعة خلايا E14 على الخلايا الليفية الجنينية للفأر المشعة بجاما حتى يتم تخفيف مجموعة الخلايا الليفية.

تم تأكيد تعدد القدرات لخلايا E14 مع تلطيخ الفوسفاتيز القلوي. بعد التمايز ، كان للأجسام الجنينية شكل دائري يزداد حجمه باستمرار. بحلول اليوم العاشر ، كان للخلايا السلفية العصبية التي تتمايز إلى خلايا عصبية شكل خلية ممدود.

تم إجراء تجارب التألق المناعي على الخلايا السلفية العصبية في اليوم الثامن ، وعلى الخلايا العصبية في اليوم 12. لوحظ تلطيخ إيجابي للتعشيش في الخلايا السلفية العصبية ، والخيوط العصبية في الخلايا العصبية. تم تمييز خط الخلايا الجذعية الجنينية للفأر الذي يعبر عن مراسل GFP الذي يحركه مروج Sox1 ، وتم إجراء قياس التدفق الخلوي على الخلايا الجذعية الجنينية والخلايا السلفية العصبية.

وجد أن 58.7٪ من إجمالي الخلايا في مرحلة NPC إيجابية GFP ، بينما 0٪ إيجابية GFP في مرحلة ESC. تم إجراء تجارب تسلسل الحمض النووي الريبي على الخلايا الجذعية الجنينية E14 والأجسام الجنينية والخلايا السلفية العصبية. تم فرز الجينات الموجودة في خريطة حرارة تسلسل الحمض النووي الريبي بناء على مستويات تعبيرها.

أظهر تحليل الأنطولوجيا الجينية لمجموعات الجينات الأربع أنها تتوافق مع وظائف أو مسارات خلوية متميزة. عند تنفيذ هذا البروتوكول ، يجب أن يظهر EBS على شكل كتل كروية سوداء من الخلايا. لضمان نمو EBS مع هذا ، قم بتغيير الوسط في اليوم الأول ، إذا بدأ الوسط في التحول إلى اللون الأصفر.

نفس النهج مهم لثقافة MPC ، حيث أن كلا من EBs و MPCs في مرحلة حرجة من التطور الجنيني المبكر. يمكن إجراء فحوصات الجينوم الوظيفية الأخرى ، مثل ChIPseek وفحوصات التقاط تأكيد الكروماتين من المراحل المختلفة لتمايز الخلايا العصبية ، لفهم العمليات البيولوجية الأساسية. يسمح الدمج عن طريق فحوصات الجينوم الكيميائية والوظيفية في عملية تمايز الخلايا العصبية للباحثين بتحديد الآليات الجزيئية للتطور الجنيني المبكر بشكل أفضل.