نهج تفكك خلية واحدة للتحليل الجزيئي للمثانة البولية في الماوس بعد إصابة الحبل الشوكي

هذا البروتوكول مهم لأنه يستخدم المعلومات البيولوجية لتسهيل توليد معلق خلية واحدة مع قابلية عالية للخلية للبقاء. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على توليد معلقات أحادية الخلية تحتفظ بقابلية عالية للخلايا وتمثيل مناسب لأنواع الخلايا المعزولة. سيظهر العملية الجراحية حسين عطا ، زميل في مختبري.

توضيح إجراء تفكك الأنسجة على علي هاشمي ، وتحليل FACS ، ياسر حشماتي. بعد التأكد من عدم الاستجابة لمنعكس الدواسة في فأر مخدر بالغ ، قم بجس أبرز عملية شوكية في العمود الفقري الصدري. يتم إعطاء التسكين والمضادات الحيوية قبل الجراحة.

احلق مستطيل طولي على الجزء الخلفي من الفأر من أسفل الرقبة إلى أسفل العملية الشائكة الأبرز مباشرة وسنتيمتر واحد على كل جانب من خط الوسط. تطهير الجلد المكشوف ثلاث مرات بمناديل متسلسلة من اليود 10٪ بوفيدون و 70٪ من الإيثانول بطريقة دائرية بدءا من موقع الشق والعمل للخارج. بعد المسح الأخير ، قم بتغطية الماوس بقطعة معقمة من إسفنجة الشاش بحجم أربعة × أربع بوصات مع نافذة فوق المجال الجراحي.

للحث على إصابة الحبل الشوكي ، قم أولا بعمل شق 1.5 سم في منتصف الظهر واستخدم تشريحا حادا لفصل العضلات عن العمليات الشائكة والصفيحة في فقرات T9 و T10 و T11. استخدم مقصا دقيقا لتقسيم الأربطة بين الشوكات بشكل حاد بين T9 و T10 و T10 و T11 قبل إجراء استئصال الصفيحة الفقرية الثنائية للعملية الشائكة T10. عندما يتم استئصال الصفيحة تماما ، استخدم المقص لتمرير الحبل الشوكي.

لقطع الأعمدة الجانبية بالكامل ، قم بمسح طرف المقص الناعم بدقة على كلا الجانبين. استخدم طرفا قطنيا معقما لضغط أي نزيف. بعد تحقيق التوازن ، أغلق الجلد بخيوط مستمرة 7-0 بولي جلاكتين 910 وقم بتوصيل مليلتر واحد من المحلول الملحي تحت الجلد لمنع الجفاف بعد الجراحة ، ثم أعد إلى قفص جديد مع المراقبة حتى الاستلقاء الكامل.

كل 12 ساعة ، أمسك بيد واحدة وتدليك أسفل البطن باليد الأخرى ، استخدم السبابة والإبهام لتحديد موقع المثانة البولية المنتفخة وضغطها برفق لتحفيز التعبير اليدوي للمثانة حتى يتمكن من التبول من تلقاء نفسه. لتحليل المصب لأنواع خلايا المثانة ذات الأهمية ، في النقطة الزمنية التجريبية المناسبة وبمجرد تخدير بشكل كاف ، قم بإجراء شق البطن في خط الوسط من الحوض إلى الحجاب الحاجز وقطع الحجاب الحاجز بعيدا عن الأضلاع. باتباع حدود الغضروف العظمي الموازي لعظم القص ، افتح الصدر على طول الأضلاع على جانبي بدءا من الحجاب الحاجز وانتقل إلى الضلع الأول.

بعد تثبيت الجدار الصدري الأمامي فوق رأس ، استخدم مقصا دقيقا لقطع التامور وتوصيل إبرة قياس 23 بجهاز التروية. أدخل الإبرة في البطين الأيسر وأدخل الإبرة ببطء إلى الشريان الأورطي دون ثقب الأنسجة. عندما تكون الإبرة في مكانها ، ابدأ في غرس الأنسجة ب PBS بمعدل تدفق 15 مليلتر في الدقيقة واستخدم أطراف زوج من المقصات الدقيقة لعمل قطع صغير بسرعة في الأذين الأيمن.

عندما يكون التصريف واضحا ويمكن ملاحظة لون كبد فاتح ، أوقف التروية وحرر المثانة من العنق الوعائي والإحليل ، ثم ضع المثانة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على محلول Tyrode المثلج. لتحضير معلق خلية واحدة ، عندما يتم جمع جميع المثانات ، قم بتمزيق أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 100 ميكرولتر من محلول Tyrode. بعد الوزن، افرم المثانتين في طبق بتري بطول 10 سم يحتوي على 100 ميكرولتر من محلول تيرود واستخدم طرف ماصة عريض التجويف لنقل شظايا الأنسجة إلى 2.5 مل من محلول الهضم لكل مثانة.

احتضان الأنسجة لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية على خلاط Nutator واستخدم ماصة سعة خمسة ملليلتر لترثرة العينة لمدة دقيقة واحدة قبل جمع الخلايا والأنسجة المنفصلة عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من محلول انفصال الخلية وضع الخلايا على خلاط Nutator لمدة إضافية 10 دقائق. في نهاية الحضانة ، اجمع الخلايا باستخدام طرد مركزي آخر وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا الحمراء.

بعد دقيقة واحدة ، أوقف التحلل بإضافة تسعة ملليلتر من PBS وقم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة 70 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 مليلتر ، ثم قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلوين المكمل بكتلة FC. بعد حضانة لمدة 10 دقائق على الجليد ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في الحجم المناسب من مزيج الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور لمدة 20 دقيقة على الجليد المحمي من الضوء. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا بملليلتر واحد من المخزن المؤقت لتلوين الخلايا وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتلوين الخلايا الطازجة المكملة بخمسة ميكرولتر من FITC Annexin V وميكرولتر واحد من يوديد البروبيديوم.

بعد 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت المرتبط Annexin إلى الخلايا واخلطها عن طريق الانعكاس. لتحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي ، استخدم أولا عينة خلية غير ملوثة لضبط معلمات التشتت الجانبية والأمامية للخلايا ، ثم قم بقياس انبعاث التألق عند 530 نانومتر وأكبر من 575 نانومتر لاستبعاد الخلايا الميتة. استخدم الشبكات الموجودة على كل لطخة نقطية لتحديد المجموعة السالبة في الاضمحلال الأول واستخدم التألق ناقص عنصر تحكم واحد لتصحيح التداخل الطيفي حتى تتم محاذاة وسطي السكان السلبية والموجبة.

ثم قم بقياس 100،000 حدث للخلايا بعلامات محددة ذات أهمية ، مما يؤدي إلى إنشاء بوابات لمجموعات الخلايا ذات الأهمية حسب الضرورة. عند تشغيل جميع العينات ، قم بتحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي المناسب. الكولاجين 1A1 والكولاجين 3A1 والكولاجين 1A2 والكولاجين 6A1 هي أكثر أنواع الكولاجين وفرة الموجودة في مثانة الفأر.

يكشف التحليل لتحديد مستويات تعبير mRNA للكولاجين واحد وثلاثة وستة وهيالورونان أن التعبير عن مكونات المصفوفة خارج الخلية أكثر انتشارا في مجموعات الخلايا الوسيطة منه في الظهارة البولية. يشير تحليل قياس التدفق الخلوي إلى أن بروتوكولات الهضم الأنزيمية المختلفة المتعددة تنتج مجموعات خلايا قابلة للحياة للغاية مع بروتوكول الهضم الثالث المستخدم في هذا التحليل الذي تم تحديده على أنه الأكثر فعالية في الحفاظ على الخلايا. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن الحصول على زيادة كبيرة في العدد الإجمالي للخلايا المعزولة من مثانات الفئران المصابة بإصابة الحبل الشوكي لمقارنتها بالتحكم في المثانات.

بالمقارنة مع الضوابط ، تظهر المثانات من إصابة الحبل الشوكي أيضا زيادة كبيرة في الخلايا الإيجابية CD45. الخطوة 7.1 مهمة لتحديد مجموعة القلب. يجب أن تكون استراتيجية البوابات مستنيرة من قبل الخلايا ذات الاهتمام.

تحتوي المثانات من اصابات النخاع الشوكي على مجموعة خلايا مميزة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لفرز الخلايا ، وزراعة الخلايا الأولية ، وتسلسل الخلية المفردة ، وغيرها من إجراءات الجزيئات والخلوية النهائية التي تتطلب خلايا مفردة قابلة للحياة. يوفر هذا البروتوكول قابلية عالية للبقاء وبالتالي فقدانا منخفضا لعدد الخلايا وهو نقطة أساسية لتقنيات تحليل الخلية المفردة مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.