مساهمة Na⁺/ K⁺ مضخة لانفجار الإيقاعي ، واستكشافها مع النمذجة وتحليلات المشبك الديناميكي

يمكن لقط ديناميكي تعديل أو إدخال أي تيار غشاء في الخلايا العصبية. نحن نقدم وتعديل مضخة البوتاسيوم الصوديوم وتيار الصوديوم المستمر في قلب حي interneuron من. باستخدام مصباح ديناميكي يسمح السيطرة الكاملة مع ضغطة مفتاح من ديناميات واتساع أي تيار أدخلت في الخلايا العصبية في الوقت الحقيقي.

تطوير أنظمة تفاعلية في الوقت الحقيقي مثل المشبك الديناميكي يدعم جميع أبحاث مؤشر كتلة الجسم. جميع جوانب الدراسات الخلوية على النشاط الكهربائي للخلايا العصبية والشبكات يمكن أن تستفيد من استخدام المشبك الديناميكي. التحديات الرئيسية لهذه التقنية هي تطوير نماذج في الوقت الحقيقي في الخلايا العصبية ومعايرة التعديلات تشنج ديناميكية إلى الخلايا العصبية المختارة للدراسة.

لعزل العقدة 7 من حبل العصب علقة، وملء طبق تشريح خط الراتنج الأسود مع حوالي سنتيمتر واحد من المالحة المبردة تكملها كلوريد الصوديوم، كلوريد البوتاسيوم، كلوريد الكالسيوم، D-الجلوكوز و HEPES في الماء المؤين ودبوس الجانب الظهري ال مخدر الباردة حتى في الغرفة. استخدام مجهر ستيريو في التكبير 20X مع إضاءة دليل الضوء المائل ومقص الربيع خمسة ملليمتر لجعل قطع طولي لا يقل عن ثلاثة سنتيمترات طويلة من خلال جدار الجسم في الجزء الثالث rostral من الجسم. استخدام دبابيس لسحب بعيدا أنسجة جدار الجسم لفضح الأعضاء الداخلية وفراغ الدم للحصول على رؤية أفضل.

عزل عصابة فردية في منتصف الجسم 7. باستخدام ملقط رقم حاد خمسة للمساعدة في توجيه القطع وعقد الجيوب الأنفية، واستخدام مقص لفتح الجيوب الأنفية التي يقيم فيها الحبل العصبي، مع الحرص على تقسيم الجيوب الأنفية الظهر والبطين. الحفاظ على الجيوب الأنفية تعلق على كل من جذور العصب الثنائية اثنين التي تخرج من العقدة، وقطع حزم العصب الضام الوردية والكودية لإزالة العقدة من الجسم وقطع الجذور الجانبية إلى حيث يخرجون من الجيوب الأنفية.

استخدام القديم حاد عدد خمسة ملقط لتأمين شرائط الجيوب الأنفية والأنسجة فضفاضة مع تقصير Minutien دبابيس الحشرات الجانب البطني حتى في أطباق بيتري واضحة مبطنة الراتنج. دبوس rostral وcaudal اتصالات بعيدة عن العقدة ممكن ودبوس الجذور بشكل آمن. زيادة تكبير المجهر ستيريو إلى 40X أو أكثر وضبط الإضاءة المائلة بحيث يمكن بسهولة رصد أجسام الخلايا العصبية على الجانب البطني من العقدة فقط تحت بيرينوريوم.

باستخدام مقص صغير، والبدء في قطع غمد الشهم فضفاضة بين الجذور على جانب واحد من العقدة، ومواصلة قطع أفقيا إلى الجانب الآخر والتأكد من الحفاظ على شفرة مقص سطحية دون الإضرار بأجسام الخلايا العصبية مباشرة تحت غمد. جعل قطع سطحية مماثلة caudally من قطع الجانبية على طول خط الوسط واستخدام fine number five ملقط لسحب رفرف واحد الجانبي caudal من غمد بعيدا عن العقدة في وقت واحد للسماح لكل أن يتم استئصالها. عندما تمت إزالة كل من اللوحات، يجب أن يتعرض كل من interneurons القلب.

ضع الطبق في إعداد التسجيل ووفر العينة بالمحلول الملحي بمعدل تدفق خمسة ملليلتر في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. لتحديد interneurons على إعداد التسجيل، حدد تكبير 50 إلى 100X مع إضاءة الحقل المظلم أدناه وتحديد موقع الخلايا العصبية HN 7 من الزوج الثنائي من خلال موقعه الكنسي في موقف posteriolateral في منتصف العقدة الجسم 7. بعد ذلك ، استخدم مناورا صغيرا لوضع قطب كهربائي صغير حاد مليء بخلات البوتاسيوم الضروس و20 ميليمولار كلوريد البوتاسيوم الكهربائي الدقيق بالقرب من جسم الخلية المستهدفة واستخدام مقياس كهربائي عصبي فيزيولوجي لمراقبة الإمكانات المسجلة باستمرار.

تعيين هذه الإمكانية إلى صفر ميليفولت واختراق الخلايا العصبية مع microelectrode باستخدام المتلاعب لدفع ببطء القطب على طول محورها الطويل. استخدم وظيفة طنين كهربية 100 مللي ثانية حتى يلاحظ تحول سلبي في إمكانات الأغشية ونشاط الارتهاك القوي. تعيين مقياس كهربية إلى ما لا يقل عن ثلاثة كيلوهيرتز في وضع المشبك الحالي متقطعة لتسجيل إمكانات الغشاء في وقت واحد أثناء تمرير التيار إلى الخلايا العصبية.

استخدم منظار الذبذبة لمراقبة إعداد القطب الكهربائي واستخدام حاقن تيار ثابت لحقن تيار ثابت من 0.1 نانوامبس ناقص لمدة دقيقة إلى دقيقتين لتثبيت التسجيل. يمكن تحديد الخلايا العصبية HN 7 من خلال شكلها الارتفاع المميز وضعف نشاط الانفجار. من أجل التوصيل الديناميكي للمشبك والتنفيذ الحالي ، افتح برنامجا ديناميكيا مخصصا لبرنامج المشبك مصمم للوحة معالجة الإشارات الرقمية.

وبينما يتم تشغيل النموذج، تعيين مضخة القصوى الحالية إلى 0.1 إلى 0.2 nanoamps وزيادة تدريجيا التوصيل الأقصى للتيار الصوديوم المستمر حتى الانفجار العادية تستتبعه. بشكل منهجي شارك تختلف هذه التيارات في 0.1 نانوامب زيادات لأقصى قدر من الناتج من مضخة الحالية وزيادات نانوسيمنس واحد لأقصى قدر من التوصيل من تيار الصوديوم المستمر وتقييم آثار هذه الزيادات على تردد ارتفاع, الفاصل الزمني بين انفجار, انفجار المدة وفترة الانفجار. عقد التوصيل القصوى للتيار الصوديوم في قيمة ثابتة محددة واكتساح في زيادات نانوية واحدة على مدى مجموعة من التيارات مضخة القصوى لدعم نشاط انفجار العادية قبل زيادة القيمة الثابتة للصلاح الصوديوم من قبل nanosiemens واحد وتجتاح أكثر من مجموعة ثانية من التيارات مضخة القصوى.

لكل زوج معلمة منفذة، جمع البيانات التي تحتوي على ما لا يقل عن ثماني رشقات نارية بحيث يمكن إجراء مقاييس متوسط موثوق بها من تردد الارتفاع، الفاصل الزمني بين انفجار، مدة انفجار، وفترة انفجار. ثم جمع البيانات من العديد من الخلايا العصبية إضافية كما أظهرت للتو لتوليد الرسم البياني المركب. باستخدام هذا النموذج، يتذبذب تيار المضخة الخارجية طوال دورة الانفجار كهناز داخلي للصوديوم حول مستوى خط الأساس.

يساهم تيار المضخة هذا في إنهاء الاندفاع أثناء مرحلة الاندفاع. فرط الاستقطاب الناتج عن تيار المضخة ينشط فرط الاستقطاب تنشيط التيار الداخلي خلال الفاصل الزمني بين انفجار. يشير نموذج اليورتورون القلبي في الوقت الحقيقي إلى أن تيار الصوديوم المستمر في ال الداخليات القلبية يساهم في الكثير من دخول الصوديوم مما يؤثر بقوة على التركيز الداخلي للصوديوم وبالتالي تيار المضخة.

لأن تيار الصوديوم المستمر نشط في إمكانات الغشاء السلبية نسبيا ، فإنه يعارض تيار المضخة خلال كل من فترات الانفجار والازوار. كما هو موضح، يتم استعادة انفجار قوي في interneurons القلب نشطة منشط من خلال إضافة مشتركة من الصوديوم المستمر وتيارات مضخة البوتاسيوم الصوديوم مع المشبك الديناميكي. وتشير النتائج الأولية إلى وجود تفاعل معقد قوي بين التيارين، يمكن مواصلة استكشافه باستخدام النموذج.

تجربة ناجحة تعتمد على desheathing جيدة من العقدة والقيادة الموجهة بعناية، واختراق، والأز من microelectrode. نحن زيادة المشبك الديناميكي من خلال تنفيذ مضخة الصوديوم تعتمد التيار الذي يتم حسابه عن طريق تقدير تركيز داخل الخلايا من أيون. ويمكن استخدام هذه التقديرات لحقن أي تيار تعتمد على الأيونات في الخلايا العصبية.