تدخل الحمض النووي الريبي في الخنافس المائية كأداة قوية للتلاعب التعبير الجيني في نقاط زمنية تنموية محددة
مايو 29, 2020
تدخل الحمض النووي الريبي هو أسلوب قابل للتطبيق على نطاق واسع وقوية للتلاعب التعبير الجيني في مراحل تنموية محددة. هنا، ونحن وصف الخطوات اللازمة لتنفيذ هذه التقنية في الغوص المائية خنفساء Thermonectus marmoratus، من الحصول على تسلسل الجينات إلى الضربة القاضية من الجينات التي تؤثر على هيكل أو السلوك.
حتى مع انتشار تحرير الجينات لدراسة الوراثة الجزيئية للكائنات غير النموذجية ، لا يزال RNAi أداة تآزرية قوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تطبيقها على مراحل مختلفة من النمو. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الضربة القاضية الجزئية لدراسة هذه الجينات الكاملة.
يعتمد نجاح الإجراء على حقن DSR وجود ضرر ضئيل. هذا يأخذ الممارسة ، لذلك لا تثبط إذا كان الأمر يتطلب بضع محاولات للحصول على ذلك الحق. لإعداد الأجنة مرحلة مبكرة للحقن الجزئي، صب أولا غليان 20٪ agarose في طبق بيتري صغيرة ووضع ثلاثة واحد إلى اثنين ملليمترات أنابيب بلاستيكية واسعة على سطح agarose السائل قبل أن يتجمد.
مرة واحدة وقد عززت agarose استخدام زوج من ملقط حادة لإزالة الأنابيب وتغطية المسافات البادئة الناتجة مع 500 ميكرولترات من الماء المقطر الأوتوكلاف. عندما حاوية جمع جاهز استخدام غرامة فرشاة طلاء الشعر الطبيعي لنقل خمسة ثماني ساعات القديمة T.marmoratus الجنين من مواقع تعشيش الخنفساء في طبق تجويف زجاجي مليئة بالماء المقطر الأوتوكلاف تحت مجهر ستيريو. باستخدام المجهر وملبابات تشريح غرامة فهم chorion من كل جنين من كلا الجانبين ومزق المشيم المفتوحة مما يسمح للجنين للانزلاق بلطف من الأنسجة.
بعد إزالة كل من طبقات الترشي من جميع الأجنة التي تم جمعها استخدام فرشاة الطلاء لنقل بعناية الأجنة من طبق تجويف الزجاج في الأخادق من لوحة agarose المعدة. لحقن الأجنة المرحلة المبكرة مع جين محدد مزدوجة تقطعت بها السبل RNA أولا إعداد الإبر الحقن المجهري على إبرة puler واستخدام المجهر ستيريو والعثور على ملقط لكسر كل طرف إلى حافة حادة. بعد رمي مخزون المنقى مزدوجة تقطعت بهم السبل RNA من الفائدة على الجليد، إضافة ميكرولتر واحد من المخزن المؤقت حقن 10X إلى الحل الناتج واستخدام المياه المقطرة مزدوجة لتحقيق حجم الفينيل من الحل إلى 10 ميكرولتر.
استخدام ماصة P10 ل الردم واحدة من الإبر microinjection المعدة مع العمل مزدوجة تقطعت بهم السبل RNA الحل وتحميل الإبرة في حامل microneedle متصلة نظام الحقن المجهري الذي يستخدم تكنولوجيا طرد الضغط. بدوره على نظام الحقن المجهري وإمدادات الهواء المضغوط واستخدام الصمام الصغير على نظام الحقن المجهري لضبط ضغط الحقن إلى 15 رطلا من الضغط لكل بوصة مربعة ثم استخدام مقبض الوقت تعديل لتعيين مدة الحقن إلى ثوان. لمعايرة حقن إبرة تقييم حجم فقاعة السوائل التي تتشكل في طرف الإبرة عند حقن في الهواء للجنين T.marmoratus استخدام حجم فقاعة الأمثل من 100 إلى 200 ميكرون.
إبرة الحقن ذات نوعية جيدة إذا كان يمكن تحقيق فقاعات الأمثل في 15 رطل من الضغط لكل بوصة مربعة مع مدة حقن حوالي ثلاث ثوان. عندما تكون الإبرة جاهزة محاذاة الإبرة على لوحة أجنة agarose بحيث تقترب الإبرة من الأجنة بزاوية 45 إلى 60 درجة. استخدم المتلاعب الصغير لتحريك الميكرون ببطء حتى تلمس التلميح سطح منتصف جنين واحد ثم قم بتحريك الإبرة بعناية إلى الأمام حتى تخترق سطح الجنين.
مرة واحدة في الإبرة داخل الجنين اضغط بعناية على زر الحقن المجهرية لتقديم واحد إلى اثنين من نانولترات من الحمض النووي الريبي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل في الجنين. عندما تم تسليم كل من الجيش الملكي النيبالي ببطء سحب الإبرة من الجنين دون التسبب في تمزق الجنين. يمكن تحديد الأجنة المحقونة بنجاح من خلال وجود بقعة ملونة في موقع الحقن.
عندما تم حقن جميع الأجنة بعناية وضع الطبق في غرفة الرطوبة في حاضنة 25 درجة مئوية تعيين إلى 14 ساعة ضوء دورة داكنة 10 ساعة لمدة أربعة إلى خمسة أيام. مراقبة تطور الجنين يوميا تحت المجهر ستيريو لتحديد شكليا مرئية knockdown الظاهريات. استخدام كاميرا رقمية عالية الدقة لتوثيق عملية التطوير.
إزالة أي أجنة ميتة وتجديد المياه على صفيحة أغاروز يوميا لتجنب جفاف وانتشار التلوث الميكروبي إلى الأجنة الأخرى الباقية خلال فترة الحضانة. قبل جمع اليرقة أولا إضافة 60 إلى 70 درجة مئوية 2٪ أغاروز السائل إلى طبق بيتري صغيرة. عندما عززت agarose استخدام ملقط حادة لجعل مجموعة ضحلة واحدة لكل يرقة ليتم حقنها في agarose واستنزاف المياه بلطف من أكواب ثقافة اليرقة.
بعد التخدير استخدام ملقط لينة منتهية لوضع اليرقة بعناية على لوحة شل مع الرقبة والهيئات في الأخادق ولكن الذيل الموجود فوق سطح agarose. عندما تم وضع كل من اليرقة ، وتغطي كل الحمم مع طبقة سميكة من agarose التي لا تزال سائلة ولكن ليس بشكل خطير الساخنة وخالية من أي حكايات التي تم تغطيتها بطريق الخطأ حسب الضرورة. لضعف تقطعت بهم السبل RNA microinjection تحميل microneedle مع الجين محددة مزدوجة تقطعت بهم السبل رنا حل العمل من الفائدة كما هو موضح.
Redrag المكبس من حقنة الحقن المجهرية التي تسيطر عليها يدويا وتحميل الإبرة على نظام الحقن المجهري. ضع اليرقة المُشلّة تحت المجهر الاستريو بحيث يكون موقع الحقن متوائمًا مع مسار إبرة الحقن المجهري بزاوية مسطحة نسبيًا. استخدم المتلاعب الصغير لتحريك طرف الإبرة بعناية إلى اليرقة وتطبيق الضغط ببطء وبعناية على الحقنة ، وتعديل ضغط الحقن وفقًا لحركة سائل الحقن الملون في الإبرة حسب الضرورة.
عندما تم حقن كل من الجيش الملكي النيبالي استخدام ملقط لينة لتحرير اليرقة من agarose ووضع اليرقة في حاوية جديدة من المياه درجة حرارة الغرفة في 25 إلى 28 درجة مئوية و14 ساعة ضوء دورة مظلمة 10 ساعة. في هذا التحليل التمثيلي تم إسقاط ثلاثة جينات مختلفة في مجموعة متنوعة من المراحل التنموية المختلفة لخنساء الغوص الشمسي T.marmoratus. يتم إجراء تدخل الحمض النووي الريبي كما هو موضح عن طريق حقن الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل في مرحلة مبكرة جدا من تكوين الجنين.
بعض الأجنة لا البقاء على قيد الحياة العملية وتحول نخرية. في هذه الصور أنها تتحكم الفردية ويمكن ملاحظة الفرد مع لون العين أخف قليلا. في هذا الفرد، ضربة قاضية أكثر شدة التي أكثر الأكاذيب البطنية من الكتلة غير مُجَدَّد تماماً ولكن الحلفاء لا تزال تظهر بعض التصبغ يمكن ملاحظتها.
هنا مثال على شخص آخر مع فقدان الصباغ كاملة أساسا في كل من العيون هو مبين. Lac2 هدمت في نتائج اليرقات في بشرة أقل مصطبغة ، تم الحصول على الأفراد البالغين أخف مع أجنحة مشوهة إلى حد ما على الأرجح بسبب ليونة غير عادية للأنسجة. تأكد من أن ننظر بدقة لمراقبة عن كثب الخاص بك حقن الحيوانات على أساس يومي وإزالة فورا أي الأفراد القتلى.
قوة هذه التقنية هي أنه يمكن تطبيقها على جينات العديد من الكائنات الحية المختلفة. وقد تم تطبيق هذه التقنية أيضا على نطاق واسع وبنجاح على علم الأحياء التطوري.
نظرة عامة
توضح هذه المقالة استخدام تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) في الخنفساء المائية Thermonectus marmoratus، مع التركيز على تطبيقها عبر مراحل نمو مختلفة. تتضمن الإجراء تحضير وحقن الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة لتحقيق كبت الجينات، مما يسمح بدراسة وظيفة الجين المتعلقة بالبنية والسلوك.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الوراثة
- علم الأحياء التنموي
الخلفية
- تداخل الحمض النووي الريبي هو تقنية قوية لتعديل التعبير الجيني.
- يمكن تطبيقها في مراحل نمو مختلفة للكائنات الحية.
- يسمح الكبت الجزئي للجينات بالدراسات الوظيفية.
- النجاح يعتمد على تقنيات حقن دقيقة.
هدف الدراسة
- لإظهار تقنية RNAi في T. marmoratus.
- لتوفير دليل خطوة بخطوة لكبت الجينات.
- لدراسة تأثيرات التلاعب الجيني على بنية وسلوك الخنفساء.
الطرق المستخدمة
- تحضير الأجنة للحقن المجهري.
- حقن الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة المخصص للجينات.
- مراقبة تطور الأجنة والتغيرات المظهرية.
- توثيق النتائج باستخدام تصوير عالي الدقة.
النتائج الرئيسية
- تم التعرف على الحقن الناجح بالبقع الملونة في مواقع الحقن.
- تمت مراقبة تطور الأجنة لدراسة أشكال الكبت المظهرية.
- تم استهداف ثلاثة جينات مختلفة في مراحل نمو مختلفة.
- تم إثبات فعالية RNAi في الكائنات الحية غير النموذجية.
الاستنتاجات
- تعتبر RNAi طريقة مجدية لدراسة وظيفة الجين في T. marmoratus.
- التقنية الدقيقة ضرورية لتحقيق الكبت الجيني الناجح.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة على الكائنات الحية الأخرى غير النموذجية للدراسات الجينية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
RNA interference (RNAi) enables targeted gene knockdown across developmental stages in non-model organisms, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines. The technique provides quantitative phenotypic readouts that help prioritize therapeutic hypotheses and reduce biological uncertainty before lead identification. Its applicability to organisms with limited genomic resources expands the scope of preclinical models for pathway clarification and functional genomics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function through stage-specific knockdown to clarify target roles in morphological and behavioral pathways.
- Operational Value: Uses cost-effective transcriptome assembly and common primer systems to generate dsRNA for any gene, reducing target validation timelines.
- Predictive Value: Generates observable phenotypes (e.g., cuticle lightening, eye depigmentation, hunting deficiency) that link genotype to function, supporting go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantifiable phenotypic outputs (e.g., pigment loss, optical defects) suitable for high-content screening workflows.
- Reproducibility: Relies on standardized microinjection protocols and immobilization techniques to ensure consistent dsRNA delivery across developmental stages.
- Scalability: Compatible with embryo and larval injection, enabling parallel testing of multiple genes across time points.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Phenotypic readouts in larval hunting behavior and cuticle formation provide mechanistic insights applicable to neurodevelopmental and structural disorder models.
- Translational Continuity: Supports progression from gene knockdown in invertebrate models to validation in vertebrate systems through conserved pathways (e.g., pigmentation, lens development).
- Risk Mitigation: Partial knockdown capability allows titration of gene suppression to model hypomorphic alleles and assess therapeutic windows.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, particularly for genes involved in development, pigmentation, and sensory function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven gene interrogation via temporal knockdown to de-risk targets before assay development.
- Screening: Enables assay standardization through reproducible dsRNA injection and immobilization, yielding quantifiable phenotypic endpoints.
- Analytics: Generates measurable outputs (e.g., pigment intensity, larval motility, cuticle hardness) that facilitate comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects gene function in T. marmoratus to conserved biological processes, supporting cross-species extrapolation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for functional genomics in non-model organisms, reducing reliance on established genetic systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers mechanistic clarity through stage-specific knockdown, reducing ambiguity in target biology and pathway involvement.
- Operational Value: Standardizes gene suppression workflows via agarose immobilization and microinjection, enhancing reproducibility across labs.
- Strategic Value: Improves target prioritization by linking gene suppression to observable phenotypes, increasing confidence in preclinical advancement.
- Portfolio Impact: Enables early de-risking of targets in understudied organisms, supporting expansion of target space and novel mechanism exploration.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection, embryo/larva handling, and dsRNA synthesis.
- Dependent on microinjection systems, agarose preparation tools, and stereo microscopy for precise delivery.
- Necessitates standardization of injection pressure, duration, and needle calibration across operators.
- Involves adaptation of immobilization protocols for different developmental stages and species.
- Limited by embryo survival rates and technical skill, requiring optimization for consistent knockdown efficiency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:37
Early stage T. marmoratus Embryo Preparation
1:58
Early Stage T. marmoratus Embryo Double Stranded RNA (dsRNA) Microinjection
5:04
T. marmoratus Larva Preparation
5:58
T. marmoratus Larva dsRNA Microinjection
7:05
Results: Representative Effects of RNA Interference in Aquatic Beetles at Different Developmental Time Points
8:18
Conclusion
![Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F1113.jpg%3Fv%3D2026-07-07T10%253A56%253A25.171Z&w=384&q=75)
