الكشف عن فيتفتورا capsici في مياه الري باستخدام Loop-بوساطة التضخيم متساوي الحرارة

الكشف عن Phytopathogen هو خطوة حاسمة في إدارة الأمراض النباتية. يوفر هذا البروتوكول طريقة الكشف السريع لتلوث مياه الري بسبب مسببات الأمراض الشائعة التي تنقلها مقاتلات منقولة بالماء. باستخدام هذه التقنية ، يمكن معالجة مسببات الأمراض المحددة ، مثل Phytophthora capcici ، والكشف عنها بسرعة من كمية كبيرة من مياه الري بينما تبقى في الموقع.

وسوف يكون إثبات الإجراء أوين هدسون ، وهو طالب الماجستير من مختبري ، وسوفيا ولي الله ، وهو باحث ما بعد الدكتوراه من مختبر Dr.Pingxi G لإنشاء مضخة وتصفية للكشف على موقع Phytophthora capcici في مياه الري. إرفاق قارورة تصفية إلى أنبوب متصل بمضخة يدوية ومجهزة قمع buchner في سدادة المطاط في فم قارورة التصفية. ثم تناسب قطعة الحجم المناسب من ورقة مرشح مع حجم الاحتفاظ 15 ميكرون في القمع.

الحصول على عينات المياه جمع مياه الري من المصدر المستهدف. وقد يكون للمياه كميات صغيرة من الحطام، ولكنها لا تحتوي على رواسب أو تربة كبيرة. صب ببطء بين 50 إلى 1000 ملليلتر من الماء اختبار على ورقة مرشح داخل القمع أثناء استخدام مضخة اليد لإنشاء شفط لسحب المياه من خلال القمع.

عند تصفية كل الماء، استخدم ملقط لإزالة ورق التصفية من القمع. واستخدام مقص معقمة لقطع ورقة إلى قطع صغيرة. غمر 8 إلى 12 قطعة من الورق في 400 ميكرولترتر من عازلة الاستخراج في أنبوب 1.5 ملليلتر لاحتضان خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

دوامة أو خلاف ذلك يهيج ورقة لمدة 10 ثانية مرة واحدة كل دقيقة. في نهاية الحضانة، استخدم ملقط لإزالة الورق مع أقل قدر ممكن من العازلة. وكرر الترخيص مع المجموعة التالية من قطعة ورقة مرشح.

لاستخراج الحمض النووي من عينات ورقة تصفية وأضاف 20 ميكرولترات من البروتينات K و 10 ميكرولتر من 10 نانوغرام لكل ميكرولتر RNAs إلى العينة أيضا واحتضان الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة مع دوامة أو تهتز كل ثلاث دقائق. في نهاية الحضانة، إضافة 500 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي في العازلة ملزمة للعينة ومزيج جيد عن طريق هز. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ضع الأنبوب ورف الفاصل المغناطيسي لمدة دقيقتين قبل إزالة المابير والتخلص منها.

إزالة أنبوب من الفاصل المغناطيسي وبقوة إعادة تعليق الخرز في 500 ميكرولترات من العازلة الغسيل. بعد 30 ثانية العودة الأنبوب إلى المغناطيس وانتظر دقيقتين قبل التخلص من افرط. كرر غسل مع 500 ميكرولترات من العازلة غسل جدا و 500 ميكرولترات من 80٪ الإيثانول كما أظهرت للتو.

والهواء محرك بيليه حبة المغناطيسي لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة إعادة تعليق الخرز في 50 ميكرولترات من عازلة elution مع pipetting لمدة دقيقة واحدة قبل وضع أنبوب مرة أخرى على المغناطيس لمدة دقيقتين للسماح لجمع من supernatant. بعد إعداد المزيج التمهيدي مصباح كما هو مبين في الجدول، إضافة في 2.5 microliters من مزيج التمهيدي 12.5 ميكرولترات من الحمم مصباح mastermix واحد ميكرولتر من الحمض النووي المستخرج وتسعة ميكرولترات من الماء المقطر مزدوجة إلى أنبوب PCR واقامة واحد إيجابي والسيطرة السلبية واحدة.

احتضان جميع العينات في 64 درجة مئوية الحرارة بلوق لمدة 45 دقيقة أو الجني ثلاثة أداة تضخيم في نهاية الحضانة، وحمولة من خمسة ميكرولترات من كل عينة تضخيم على هلام agarose 1٪وصورة العصابات الناتجة على آلة التصوير فوق البنفسجية. إذا تم استخدام صبغة كالوريمترية، عرض تغيير اللون لتحديد النتائج كـ موجبة أو سالبة. إذا تم استخدام أداة تضخيم محمولة، اعرض الرسم البياني للتضخيم على الشاشة لتحديد النتائج.

الوقت البصري لتشغيل مقايسة المصباح في 64 درجة هو 45 دقيقة، كما لا يتم تضخيم أدنى تركيزات التي كانت إيجابية للكشف حتى 40 دقيقة، في حين يتم تضخيم تركيزات أعلى في 20 دقيقة. يمكن تأكيد التضخيم على جل agarose 1٪ المسمى مع وصمة عار من حمض النووي. كما يتضح PCR التقليدية هي 40 مرة أقل حساسية من مصباح.

الكشف عن 4.8 مرات 10 إلى ثالث حدائق الحيوان في تركيزات المليلتر في أدنى. وفي هذا التحليل، تم جمع عينات من المياه من سبع أحواض تستخدم لإنتاج الخضروات التجارية في مقاطعة تيفت، جورجيا. ثلاثة منها أظهرت نتائج إيجابية مصباح.

عندما تم اختبار العينات بواسطة PCR التقليدية ومع ذلك، تم الكشف عن حدائق الحيوان في واحدة فقط من العينات الثلاث الإيجابية. في هذا الجدول، يتم تلخيص الاختلافات بين طرق الكشف باستخدام متغيرات مثل الحساسية والوقت والإعداد المطلوب والمواد والتكلفة. مصباح هو الأسلوب الأقل تكلفة بين الأساليب التي تم اختبارها، وأيضا هو الأسرع، والتي تتطلب فقط 30 إلى 60 دقيقة للتضخيم مقارنة مع التضخيم PCR التقليدية.

باستخدام هذا البروتوكول الحمض النووي المستخرجة من مسببات الأمراض البذور UMI وثيقة الصلة النتائج في أي كشف لأي من العينات، مما يؤكد خصوصية التمهيديات. تأكد من عدم صب الماء العينة بسرعة كبيرة، وتوخي الحذر عند إضافة الحمض النووي المستخرج إلى أنابيب المصباح للحد من التلوث. وبمجرد أن تكون مسببات الأمراض الأخرى المنقولة بالمياه قد تم تطوير مجموعاتها التمهيدية المحددة ، يمكن تكييف أساليب الترشيح وحمض المصباح لمسببات الأمراض الأخرى.