الأكسجين الناجم عن نموذج اعتلال الشبكية لأمراض الشبكية الإقفاري في القوارض

بعد تطويره ، أصبح نموذج اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين مستخدما على نطاق واسع في الدراسات قبل السريرية لأمراض الشبكية الوعائية الجديدة. وقد تم استخدامه كنموذج لدراسة تكوين الأوعية المرضية استجابة لنقص الأكسجة. الميزة الرئيسية لهذا النموذج هي أنه يحفز استجابة عصبية وعائية قوية قابلة للتكرار ويمكن قياسها بسهولة.

يمكن استخدام هذا النموذج كنموذج قبل السريري لدراسة آثار المرشحين العلاجيين المحتملين. يعتبر نموذجا مناسبا للعديد من الأمراض البشرية ، مثل اعتلال الشبكية الخداجي ، واعتلال الشبكية السكري ، والتنكس البقعي الرطب المرتبط بالعمر. سجل وزن قبل وبعد تحريض نقص الأكسجة وفي وقت التضحية.

تأكد من وجود ما يكفي من الطعام في قاع القفص وأضف الجير الصودا مع مؤشر اللون إلى قاع الغرفة لامتصاص ثاني أكسيد الكربون الزائد عند عدم استخدام نظام الترشيح. راقب الرطوبة ودرجة الحرارة داخل الغرفة ، مع الحفاظ على الرطوبة بين 40 و 65٪ إذا لزم الأمر ، قم بزيادة رطوبة الغرفة عن طريق وضع الأطباق التي تحتوي على الماء في القاع. معايرة مستشعر الأكسجين بهواء الغرفة العادي والأكسجين بنسبة 100٪.

ثم ضع الفئران P7 في غرفة واضبط مستوى الأكسجين على 75٪ احتفظ بالفئران في الغرفة لمدة خمسة أيام حتى P12 ، ومراقبة أثناء الاستقراء. عند الانتهاء ، أخرج الفئران من الغرفة. قم بوزن ووضع علامات تعريف على الذيل أو الأذن.

بعد تخدير ، قم بإجراء قرصة إصبع القدم. رد فعل صغير مقبول. احتفظ بالحيوان على وسادة تدفئة أثناء العلاج.

استخدم حقنة زجاجية بإبرة قياس 33 إلى 34 لحقن IVT. ضع قطرة من اليود ، ثم اضغط على الجفن لأسفل وامسك مقلة العين بالملقط. اجعل الحقن خلفيا للطيف ، بزاوية 45 درجة تقريبا تشير إلى العصب البصري.

حافظ على الإبرة في مكانها لمدة 30 ثانية بعد حقن الدواء لتجنب ارتجاع المحلول المحقون. افحص العين بحثا عن أي مضاعفات مثل النزيف أو تلف الشبكية بعد إزالة الإبرة. ضع مرهم مضاد حيوي فوق العين بعد الحقن.

إذا رغبت في ذلك ، قم بإجراء التصوير في الجسم الحي على الحية خلال فترة المتابعة لتسجيل التغييرات التي تتطور في شبكية العين أثناء الاستجابات للأوعية. استخدم التصوير المقطعي للتماسك البصري للمجال الطيفي لتصور طبقات الشبكية في الجسم الحي. اجمع عيون عن طريق قطع الأنسجة حول العين ، والإمساك خلف مقلة العين بالملقط المنحني ورفع العين من المدار.

احتضن مقل العيون في 4٪ بارافورمالدهيد مصفى حديثا لمدة ساعة إلى أربع ساعات. قم بإزالة المثبت واغسل مقل العيون ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 10 دقائق لكل غسلة. قم بتشريح شبكية العين على الفور أو قم بتخزينها في PBS عند أربع درجات مئوية.

قم بإعداد حوامل مسطحة للشبكية لتحديد كمية الأوعية الدموية الجديدة وحجم المناطق اللاوعائية أو AVAs. قم بتشريح شبكية العين تحت مجهر استريو باستخدام مقص دقيق وملقط. ضع مقلة العين في PBS لإبقائها رطبة وثقبها عند الطرف بإبرة قياس 23 ، ثم قم بقصها حول الطرف بمقص دقيق منحني لإزالة القزحية والقرنية.

ضع طرف المقص بحذر بين RPE والشبكية العصبية وقم بقص مركب الصلبة المشيمية RPE باتجاه العصب البصري. افعل الشيء نفسه مع الجانب الآخر من مقلة العين. ثم قم بقص الأنسجة برفق أو تمزيقها حتى ينكشف كوب الشبكية.

اسحب العدسة للخارج من كوب الشبكية وأضف PBS إلى الكوب. قم بإزالة جميع الأوعية الهيالودية والجسم الزجاجي والحطام دون الإضرار بشبكية العين. قم بعمل أربعة شقوق في شبكية العين بمقص دقيق مستقيم لإنشاء هيكل يشبه الزهرة.

استخدم فرشاة رسم ناعمة أو ماصة نقل لنقلها إلى لوحة بئر للتلطيخ. قم بتسمية الأوعية الدموية الشبكية ب isolectin B4 الذي يلطخ سطح الخلايا البطانية. احتضان شبكية العين في المخزن المؤقت للحجب لمدة ساعة واحدة واغسلها باستخدام 1٪ NGS و 0.1٪ Triton في TBS لمدة 10 دقائق.

احتضان شبكية العين ب 5 إلى 10 ميكروغرام لكل مليلتر صبغة الفلورسنت المترافقة ب B4 بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية أثناء حمايتها من الضوء. في اليوم التالي ، اغسل شبكية العين ثلاث مرات باستخدام 1٪ NGS و 0.1٪ Triton في TBS لمدة 10 دقائق لكل غسلة. ضع شبكية العين على مجهر ، وانزلق شبكية العين الداخلية متجهة لأعلى.

ثم انشر شبكية العين بعناية باستخدام فرشاة رسم ناعمة وقم بإزالة أي أوعية أو حطام هيالويد متبقي. أضف وسيط التثبيت أعلى العينة وضع غطاء أعلى الشريحة. قم بتخزين شبكية العين على حرارة أربع درجات مئوية محمية من الضوء.

قم بتصوير حوامل الشبكية المسطحة باستخدام مجهر مضان بهدف 10X. ركز على الضفيرة الوعائية السطحية والأوعية الدموية الجديدة قبل الشبكية. قم بعمل صورة مسح ضوئي للبلاط لالتقاط شبكية العين بالكامل ودمج عمليات مسح البلاط.

قم بقياس الصور عن طريق قياس AVAs ، ومنطقة الأوعية الدموية الجديدة ، ومساحة الشبكية الكلية باستخدام برنامج معالجة الصور. ارسم AVAs ومساحة الشبكية الإجمالية باستخدام أداة الرسم اليدوي وحدد مناطق الأوعية الدموية الجديدة باستخدام أداة التحديد. في نموذج اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين في الفأر ، يحدث طمس الأوعية في شبكية العين المركزية.

أثناء وجوده في نموذج الفئران ، يتطور في المحيط على غرار اعتلال الشبكية البشري. يتطور الأوعية الدموية الجديدة قبل الشبكية بالقرب من المناطق اللاوعائية ، وتحديدا الشبكية المركزية في الفأر والمحيط في الفئران. يمكن إجراء التحليل النسيجي باستخدام المقاطع العرضية أو الحوامل المسطحة لتقييم التغيرات المورفولوجية في شبكية OIR أو وجود أنواع الخلايا ذات الأهمية ، على سبيل المثال ، الخلايا الالتهابية.

اختياريا ، يمكن إجراء التصوير غير الجراحي في الجسم الحي خلال فترة متابعة OIR. يمكن تصور الأوعية الدموية في الشبكية والهيالويد باستخدام تصوير الأوعية بالفلورسين ويمكن استخدام التصوير المقطعي البصري للتماسك البصري في المجال الطيفي لتقييم التغيرات الهيكلية في شبكية العين. يمكن قياس التغيرات الوظيفية عن طريق تخطيط كهربية الشبكية.

Aflibercept ، وهو مصيدة VEGF القابلة للذوبان ، تمنع إعادة توعية الأوعية الدموية الجديدة والفسيولوجية في OIR. تحتوي عيون OIR المحقونة في P14 بجرعة عالية من aflibercept على AVAs في الشبكية أكبر من العيون غير المعالجة ، مما يشير إلى أن aflibercept يمنع أيضا إعادة توعية الشبكية الفسيولوجية الناجمة عن نقص الأكسجة. عند محاولة هذا البروتوكول ، تذكر أن تفكر في حجم القمامة المناسب لتجربتك مسبقا ومراقبة رفاهية السدود والجراء في غرفة الأكسجين.

ضع في اعتبارك أن زيادة الوزن بعد الولادة تؤثر على النتيجة في النموذج. يمكن استخدام عينات الشبكية التي تم الحصول عليها من هذا النموذج للطرق التحليلية ، مثل الكيمياء المناعية ، وتحليل التعبير الجيني أو البروتين ، ولقياس تأثيرات المرشحين العلاجيين المحتملين على شبكية العين على المستوى الجزيئي.