تقنيات الكيمياء الهيستولوجية المناعية لتحليل الانتشار الخلوي وتكوين الخلايا العصبية في الفئران باستخدام Thymidine Analog BrdU

هذا بروتوكول رئيسي في مجال تكوين الخلايا العصبية للبالغين. نقدم هنا وصفا مفصلا للخطوات المطلوبة لتحقيق تلطيخ ناجح. تتيح هذه التقنية تحديد بروتينات معينة يتم التعبير عنها بشكل مشترك في الخلايا المنقسمة مع الحفاظ على سلامة الأنسجة.

نوصي باختبار الأجسام المضادة للأنسجة والحالات مسبقا. الخطوات الحاسمة هي نفاذية الغشاء ، وتمسخ الحمض النووي الدقيق ، واختبار أوقات خطوات الحجب والغسيل. يمثل توحيد هذه التقنية تحديا للمختبرات الجديدة.

يعد تحضير الكاشف وإدارة نظير الثايميدين في القوارض أمرا بالغ الأهمية لتحقيق النتائج الناجحة بالنسبة لإدارة BrdU التناظرية للثايميدين ، قم بتثبيت تجويف البطن السفلي لكبح جماح الفئران التجريبية واستخدم حقنة سعة ملليلتر واحد مزودة بإبرة قياس 23 لحقن محلول BrdU معد حديثا 50 ملليغرام لكل كيلوغرام داخل الصفاق في. عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة ، اجمع الدماغ وقم بتجميد الدماغ للسماح بالحصول على أقسام إكليلية بسمك 40 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم ناظم البرد ووضع الأقسام في آبار فردية من لوحة ثقافة خلية 24 بئرا في محلول حماية التبريد بترتيب تجميعها. عندما يتم جمع جميع الأقسام ، قم بتخزين العينات عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى بضعة أشهر.

لتقييم تلطيخ BrdU ، باستخدام تفاعل بيروكسيداز ، مع مركب أفيدين - بيوتين - بيروكسيداز ، انقل الشرائح من محلول الحماية بالتبريد إلى 0.1 مولار PBS حتى تصل العينات إلى درجة حرارة الغرفة واشطف الأنسجة ثلاث مرات لمدة 10 دقائق باستخدام 0.1 مولار PBS طازج لكل غسلة. بعد الغسيل الأخير ، يحتضن الأقسام في محلول حجب البيروكسيديز الداخلي لمدة 30 دقيقة ، في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بثلاث غسلات لمدة 10 دقائق في 0.1 مولار PBS. بعد الغسيل الأخير ، احتضان الأقسام لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في اثنين من حمض الهيدروكلوريك المولاري متبوعا بشطف واحد لمدة 10 دقائق في محلول بورات 0.1 مولار.

بعد ثلاث غسلات في البرد المثلجي 0.1 مولار PBS ، احتضان العينات لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في محلول PBS + حجب ، متبوعا بحضانة ليلية بالجسم المضاد الأساسي للفأر المضاد ل BrdU في PBS + عند أربع درجات مئوية. بعد ثلاث غسلات من PBS 0.1 مولار ، احتضن العينات لمدة ساعتين إلى أربع ساعات باستخدام الجسم المضاد الثانوي المناسب للفأر البيوتينيل في PBS + في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل ، عالج الأقسام بمحلول ABC لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، متبوعة بثلاث غسلات PBS 0.1 مولار.

بعد آخر غسيل ، انقل الشرائح إلى DAB-Peroxidase Substrate Solution لمدة دقيقتين إلى 10 دقائق حتى تصبح الشرائح رمادية داكنة. إذا كان من الممكن تصور الخلايا الإيجابية ، اشطف العينات بثلاث غسلات بماء الصنبور لمدة 15 دقيقة متبوعة بثلاث غسلات PBS 0.1 مولار. بعد الغسيل الأخير استخدم فرشاة ناعمة لتركيب الشرائح بعناية على شرائح جيلاتينية ، لتجفيف الهواء طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.

في صباح اليوم التالي ، استخدم وسيط التثبيت الدائم لوضع زلات الغطاء فوق العينات. لتحديد الخلايا الموجبة BrdU ، أولا ، استخدم التكبير 4x ، على المجهر ، لتحديد التلفيف المسنن والبحث بعناية في طبقة الخلية الحبيبية على طول المحور Z للنوى المسماة BrdU. بعد تحديد قسم الفاصل الزمني للبحث عن الخلايا في جميع أنحاء التلفيف المسنن ، احسب جميع الخلايا الموجبة BrdU.

يمكن أن يتغير مورفولوجيا النواة المسماة اعتمادا على مقدار BrdU الذي تتضمنت الخلية. تحرك ببطء فوق المحور Z لتحديد جميع النوى من 10 أقسام على الأقل لكل وخمسة على الأقل لكل مجموعة تدمج مجموعة. لفك الالتفاف للصورة ، افتح المكون الإضافي 3D لوظيفة انتشار نقطة الحيود ، واملأ جميع البيانات المطلوبة ، وانقر فوق "موافق" واحفظ الملف.

بعد ذلك ، افتح المكون الإضافي DeconvolutionLab2 واسحب صورة Z-stack المتطابقة وملف PSF إلى فتحة النافذة المقابلة. حدد خوارزمية الالتفاف وعدد التكرارات، وانقر فوق تشغيل. لدمج الصور غير المعقدة في صورة Z-stack واحدة، حدد Image and Stacks وانقر فوق Z project.

من قائمة نوع الإسقاط، حدد الحد الأقصى للكثافة. انقر فوق موافق واحفظ الملف. لإنشاء صورة RGB، حدد Image and Color وانقر فوق Merge Channels لتعيين الصورة المقابلة إلى قناة اللون المطلوبة من القائمة المنسدلة.

ثم قم بإلغاء تحديد المربع إنشاء مركب. انقر فوق موافق واحفظ الملف. عند إنشاء جميع صور القناة، افتح ملفين على الأقل من ملفات الصور وحدد قنوات ألوان مختلفة لكل ملف صورة لإنشاء صورة RBG.

في هذه الصور ، يمكن ملاحظة أقسام التلفيف المسننة التمثيلية مع الخلايا المسماة BrdU. كما لوحظ في هذه الصور المكبرة للأقسام ، تظهر الخلايا المسماة تلطيخا داكنا شديدا. من غير المؤكد أن هناك اختلافات كبيرة في أعداد الخلايا الإيجابية BrdU بين الفئران الخاضعة للرقابة التي لم تخضع للنشاط البدني والمجموعة التجريبية التي تعرضت للنشاط البدني ، بما يتفق مع النتائج الأخرى المبلغ عنها والتي أظهرت أن النشاط البدني يزيد من التكاثر الخلوي في التلفيف المسنن البالغ.

عند محاولة هذا البروتوكول ، استخدم المحاليل المعدة حديثا وتعامل مع الأنسجة برفق. الحصين عرضة للانفصال عن بقية الشرائح عند معالجته ويمكن أن يفوتها. يمكن تكييف هذا الإجراء لتقييم تسمية الحمض النووي ومؤشر تخليق الحمض النووي ومضاعفة دراسات تكاثر الخلايا الملونة.

نأمل أن يكون هذا الجهد مفيدا للمجتمع العلمي وأن يسهل الإجابة على أسئلة جديدة في دراسة تكاثر الخلايا ، عندما تكون تقنية الكيمياء المناعية.