التصوير الحيواني كله من الميلانوغاستر Drosophila باستخدام التصوير المقطعي microcomputed

يسمح هذا البروتوكول بالتصوير غير المدمر لدقة ميكرون المختبر السليمة أو الناعمة. يمكن استخدامه لفهم آليات فسيولوجيا وتشريحه وتطوره. نظرا لأن الذباب يتم تصويره في حالة سليمة دون الحاجة إلى تشريح الأنسجة ، يتم الحفاظ على البنية المكانية للأنسجة والأعضاء في حالتها الأصلية ويمكن ملاحظتها بسهولة.

المقطعي المحوسب الصغير أداة مثالية للدراسات التي تهدف إلى نمذجة الأمراض التي تصيب الذباب ، أو لفهم عيوب النمو التي تؤثر على نوعية الحياة. كما أثبت أنه مفيد في تخصصات أخرى ، مثل الهندسة والفيزياء وعلوم المواد والجيولوجيا والأنثروبولوجيا. بعد اختيار النقطة الزمنية التنموية ذات الأهمية للتصوير ، قم بنقل 5 إلى 20 إلى مليلتر واحد من PBST في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر ، واحتضان الأنبوب لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع النقر الدوري للمساعدة في إزالة الطلاء الكارهة للماء والسماح للحيوانات بالغمر بالكامل.

في نهاية الحضانة ، استبدل PBST بمليلتر واحد من محلول Bouin واضغط على الأنبوب لغمر الذباب بالكامل. بالنسبة لعينات اليرقات والشرانة ، بعد حضانة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، اغسل ثلاث مرات لمدة خمس دقائق ومليلتر واحد من PBS الطازج لكل غسلة. بعد الغسيل الأخير ، انقل العينات إلى طبق تشريح متعدد الآبار يحتوي على PBS طازج لكل بئر تحت مجهر تشريح ، واستخدم دبوسا صغيرا متصلة بحامل لعمل ثقب في البشرة الأمامية والخلفية لكل عينة ، مع الحرص على عدم تعطيل الأنسجة الرخوة الأساسية.

بعد اختراق البشرة ، احتضان العينات في مليلتر واحد من محلول Bouin الطازج في أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة قبل غسل العينة ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة ومليلتر واحد من مخزن غسيل مقطعي مقطعي محوسب لكل غسلة. بعد الغسيل الأخير ، أضف ملليلترا واحدا من محلول التلوين المناسب إلى الأنبوب واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين إلى سبعة أيام. إذا كان الحفاظ على الصورة لفترة أطول ضروريا ، فقم بتجفيف العينات داخل سلسلة الإيثانول الصاعدة في مليلتر واحد من الإيثانول لمدة ساعة واحدة لكل تركيز كما هو موضح ، لإعداد العينات لتجفيف النقاط الحرجة.

لتركيب عينات مجففة من النقاط الحرجة ، ضع العينات في أنابيب شعرية بلاستيكية أو زجاجية قبل تركيب الأنابيب على حامل المرحلة الدوار. لتركيب العينة الرطبة، املأ طرف الماصة P10 بالماء وقم بتأمين الطرف الضيق بغشاء البارافين. استخدم الملقط لنقل عينة واحدة إلى طرف الماصة واستخدم جسما طويلا ونحيفا لدفع العينة بعناية لأسفل إلى الطرف حتى تلامس جدار الطرف لتثبيت العينة في مكانها.

بعد تغطية الطرف المفتوح للماصة، قم بتركيب الماصة P10 على حامل مصمم ليناسب الجزء السفلي من مرحلة الدوران. للمسح الضوئي، انقر فوق أيقونة Open Door في برنامج الماسحة الضوئية للوصول إلى وقاف المرحلة الدوارة وشد الياقة حول قاعدة حامل العينة لتوصيل العينة. اضبط معلمات المسح الضوئي في البرنامج للحصول على الدقة والتباين الأمثل وانقر فوق الخيارات ومصدر الأشعة السينية لفتح التحكم في طاقة مصدر الأشعة السينية.

استخدم أشرطة التمرير لضبط جهد الأشعة السينية على 30 إلى 40 كيلو فولت والتيار إلى 100 إلى 110 ميكرو أمبير لإنتاج شعاع أشعة سينية بقوة من ثلاثة إلى أربعة واط وحجم بقعة صغير. لتعيين عدد صور العرض التي سيتم الحصول عليها أثناء عمليات الفحص، حدد الخيارات وأوضاع الاكتساب لضبط وقت تعرض الكاميرا على 500 إلى 800 مللي ثانية واستخدم شريط التمرير لتعيين حجم بكسل الصورة المطلوب وفقا لإعدادات الكاميرا وموضعها. انقر فوق شريط التمرير واسحبه لتحريك العينة على طول مسار الدوران بزاوية 360 درجة، مع إبقاء العينة داخل مجال الرؤية.

انقر فوق أيقونة بدء الاستحواذ. سيظهر مربع حوار يسمح بتعيين معلمات مسح ضوئي إضافية. قم بتسمية الملف ومجلد الإخراج الذي سيتم حفظ الفحص فيه.

اضبط الحركة العشوائية على 10 والمتوسط على أربعة إلى ستة إطارات. سيتم حساب خطوة التدوير تلقائيا بناء على إعدادات الكاميرا المستخدمة، ثم انقر فوق موافق لبدء الاستحواذ. سيظهر مربع حوار شريط التقدم الذي يعرض وقت المسح وسيبدأ الماسح الضوئي في الحصول على سلسلة من صور الإسقاط للعينة على طول مسار الدوران.

لإنشاء الصور المقطعية، افتح صور العرض في برنامج إعادة الإعمار وحدد خوارزمية تصحيح الإزاحة لإجراء محاذاة أولية للصورة. حدد أفضل قيمة تقوم بمحاذاة صور الإسقاط بشكل صحيح وانقر فوق Finetuning لضبط كل معلمة إعادة إعمار. سيتم إنشاء سلسلة من المعاينات التي يمكن استخدامها لتحديد القيم الصحيحة.

تأكد من عرض قيم المعلمات المثلى في علامة التبويب الإعدادات، وفي علامة التبويب الإخراج، اضبط معلمات الملف مثل عمق البت واسم الملف والمجلد الذي سيتم حفظ البيانات فيه. يمكن استخدام منطقة الاهتمام لإعادة بناء الهياكل ذات الأهمية فقط. إذا كانت هناك حاجة إلى عمليات إعادة بناء متعددة، فانقر فوق ابدأ وإضافة إلى الدفعة لإضافة الصورة الحالية إلى مدير الدفعات وكرر إعادة البناء للصور المتبقية.

للتحليل المورفومتري للصور المعاد بناؤها ، ضمن علامة التبويب Segment ، في برنامج التحليل المورفومتري المناسب ، انقر فوق Basic and New ، وقم بإعطاء الصورة اسما جديدا ، وحدد لونا مناسبا. حدد المربع تحديد النطاق واضبط شريط التمرير لضبط نطاق العتبة الذي يشمل بنية الاهتمام. لرسم منطقة محددة بواسطة العتبة، اضغط مع الاستمرار على مفتاح التحكم أثناء الضغط باستمرار على مفتاح الماوس الأيسر.

لإزالة منطقة، اضغط مع الاستمرار على مفتاح Shift أثناء الضغط باستمرار على مفتاح الماوس الأيسر. تأكد من عرض قياسات منطقة الشبكة ذات الأهمية في لوحة المعلومات للتحليل المورفومتري الأساسي. قم بعرض كائن الشبكة وصورة التصوير المقطعي بأكملها ، وتصور الصورة الناتجة في 3D ، ثم انقر بزر الماوس الأيمن لتحديد Show Movie Maker لإنشاء فيديو للكائن باستخدام إطارات فردية من العارض.

في هذه الصور ، يمكن ملاحظة جنين ، ويرقة الطور الثالث ، وخادرة في مرحلة البلوغ ، وذبابة أنثى بالغة ملطخة باليود وتم تصويرها في الماء باستخدام ماسح ضوئي تجاري على مقاعد البدلاء. يتضح الحفاظ الممتاز وحتى تلطيخ الأنسجة الحساسة ، مما يسمح بالتعرف بسهولة على جميع الأعضاء الرئيسية. هنا ، يتم عرض مقارنة بين نفس غطاء رأس الذبابة البالغ ، الذي تم الحصول عليه في كل من وضع مسح الإسقاط البطيء والسريع.

الأهم من ذلك ، على الرغم من أن الدقة في الصور البطيئة أعلى ، إلا أن التحليل المورفومتري لا يختلف بين عمليات المسح البطيئة والسريعة. باستخدام برنامج العرض ، يمكن تقسيم أي نظام أنسجة أو عضو ذي أهمية واستخدامه للتحليل المورفومتري والتصور ثلاثي الأبعاد. في هذه الصور ، يمكن ملاحظة بطن ذبابة ملطخة بحمض الفوسفوتونغستيك وتم تصويرها أثناء ترطيب الماء أو بعد تجفيف النقطة الحرجة على مجهر الأشعة السينية.

باستخدام حمض الفوسفوتونغستيك ، يتم حل الخلايا الظهارية الفردية للأمعاء الوسطى المنوية داخل الخصيتين بسهولة. في حين أن صور تجفيف النقطة الحرجة تظهر دقة متزايدة بشكل هامشي مقارنة بالعينة الرطبة ، يتم تحقيق الحفاظ بشكل أفضل على البنية التحتية للأنسجة الحساسة باستخدام عينات رطبة ، مثل الخلايا الدهنية بالقرب من البشرة. للحصول على أفضل دقة ، قلل من حركة العينة والاهتزازات الزائدة.

يعد تأمين العينة إلى المسرح أمرا بالغ الأهمية لهذا الغرض ، على الرغم من أن الإبداع وسعة الحيلة قد تكون مطلوبة لتحقيق ذلك. يمكن استخدام طرق التصوير الإضافية ، مثل المجهر الضوئي والإلكترون ، كجزء من سير عمل التصوير من أجل فهم طفرة جينية معينة من المقياس النانوي إلى الكائن الحي بأكمله.