عزل وزراعة الخلايا الجذعية النخاعية النخاعية النخاعية في الفئران

أظهرت الدراسات أن BMSCs المشتقة من عظام الوجه القحفية تظهر قدرات أعلى من تلك الموجودة في العظام المحورية والزائدية. لذلك ، تعتبر BMSCs للفك السفلي هي المورد المفضل لتطوير العلاجات المستقبلية للأمراض القحفية الوجهية. يجمع هذا البروتوكول بين مزايا التصاق نخاع العظم الكامل وفرز الخلايا الفلورية للحصول على أعداد كبيرة من BMSCs للفك السفلي المنقى في وقت قصير.

إذا كنت تجرب هذا البروتوكول لأول مرة ، أعتقد أنه من المهم جدا فهم التركيب التشريحي والحركة الوظيفية للفك السفلي للفئران ، والتي يمكن تحقيقها من خلال مشاهدة هذا الفيديو أو قراءة الأدبيات ذات الصلة. بعد القتل الرحيم للفأر ، ضعه في غطاء دخان نظيف في وضع ضعيف. شق الجلد وعضلات البوكيناتور من الزوايا الثنائية إلى المنطقة الخلفية من الفك السفلي.

افتح فم الفئران عن طريق دفع القواطع الفكية والفك السفلي نحو الاتجاه المعاكس بكلا الإبهام ، لفضح أسنان الفك السفلي ، والتي ترتبط بالفك السفلي. افصل تماما عضلات الخد والأوتار المرتبطة بالغرابي والحدود السفلية للفك السفلي. ثم اضغط على الأسنان الخلفية للفك السفلي وقم بتدويرها للخلف ولأسفل حتى تتعرض اللقمة على كلا الجانبين بوضوح.

افصل الجسم الفك السفلي عن الجمجمة ، ونظف الأنسجة الرخوة الملتصقة على سطح العظام باستخدام شاش مبلل. ضع العظم في طبق زجاجي معقم بطول 10 سم مملوء بالحد الأدنى من ألفا المتوسط الأساسي المبرد مسبقا ، أو PBS على الثلج ، للحفاظ على الجدوى. اقطع العظم الأمامي على طول الحافة المتوسطة للضرس الأول من جسم الفك السفلي ، ثم قم بإزالة الراموس الفكي السفلي بما في ذلك الغرابي واللقمة على طول الحافة البعيدة للضرس الثالث لفضح تجويف النخاع.

املأ طبقا زجاجيا معقما بطول 10 سنتيمترات ب 10 ملليلتر من ألفا ميم بنسبة 10٪ FBS. قم بشفط الوسط بحقنة سعة 10 مليلتر ، ثم أدخل الإبرة في تجويف نخاع العظم واغسل نخاع العظم بشكل متكرر في الطبق. اغسل تجويف العظام ثلاث مرات على الأقل من الجانبين الوسطي والبعيد من العظم على التوالي ، حتى يتحول لون العظم إلى اللون الأبيض.

انقل الوسائط التي تحتوي على الخلايا المتدفقة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر ، وقم بطردها عند 800 دورة في الدقيقة ولمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا بثلاثة ملليلتر من ألفا ميم مع 10٪ FBS. ضع الخلايا في طبق استزراع جديد بحجم 10 سم واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.

استنشق وسط الثقافة واغسل الطبق باستخدام PBS. أضف ملليلترين من 0.25٪ تريبسين مع 0.02٪ EDTA في الطبق وهضم الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم أضف أربعة ملليلتر من alpha-MEM مع 10٪ FBS لإيقاف التفاعل.

انقل معلق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر وقم بتشغيله بجهاز طرد مركزي بسرعة 800 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. أعد تعليق الخلايا في 120 ميكرولتر من PBS مع 10٪ FBS بعد الطرد المركزي. انقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.

قم بسد معلقات الخلية بميكرولتر واحد من الجسم المضاد ضد CD16 من خلال CD32 عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة ، وصمة عار الخلايا بجسم مضاد مترافق ب PE ضد CD45 ، والجسم المضاد المترافق FITC ضد CD90 ، والجسم المضاد APC ضد CD29 ، عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة في الظلام. استخدم 20 ميكرولترا أخرى من تعليق الخلية كتحكم سلبي غير ملطخ. الطرد المركزي الأنابيب عند 800 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.

تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 0.5 مل من PBS مع 10٪ FBS. أضف 10 ميكرولتر من 0.01 ملليغرام لكل مليلتر DAPI قبل 10 دقائق من التحليل. استخدم مرشحات 40 نانومتر موضوعة على أنابيب الطرد المركزي لتصفية الخلايا ، ثم قم بتحليل الخلايا على فارز الخلايا المنشط بالفلورة.

قم أولا بإزالة الخلايا الميتة من إجمالي عدد الخلايا عن طريق بوابات الخلايا السالبة DAPI ، ثم بوابة CD29 الإيجابية ، CD90 الإيجابية ، CD45 السلبية ، في الخلايا المحددة كمستهدفة mBMSCs. اجمع mBMSCs التي تم فرزها في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر مع خمسة ملليلتر من alpha-MEM مع 10٪ FBS. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 800 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق وقم بإزالة المخزن المؤقت للتجميع.

أضف ملليلترا واحدا من الوسط الطازج لإعادة تعليق الخلايا ، ثم قم بوضعها في طبق ثقافة بطول ستة سنتيمترات. باستخدام هذا البروتوكول ، التزمت نسبة كبيرة من الخلايا باللوحة في اليوم الثالث بعد الثقافة الأولية. بعد ثلاثة إلى أربعة أيام إضافية من الثقافة ، وصل التقاء الخلايا إلى 70 إلى 80٪ تم استخدام فرز الخلايا الفلورية لتنقية mBMSCs التي تمثل حوالي 81.1٪ في خلايا P0.

بعد زراعة P2 mBMSCs في صفيحة من ستة آبار لمدة أسبوع ، لوحظت كمية كبيرة من وحدات تشكيل المستعمرات. لتقييم قدرة التمايز متعدد السلالات ل mBMSCs ، تم تحريضها في سلالات عظمية غضروفية وأديبو. زيادة نشاط ALP ، والعقيدات الكلسية الحمراء تحت تلطيخ الأيزارين الأحمر ، وزيادة التعبير عن الجينات المحددة العظمية Runx2 و Alp و Bsp و Ocn ، إلى تحريض العظم.

تم استخدام تلطيخ الزيت الأحمر O لتحديد تكوين الشحم. كانت العديد من الفجوات الغنية بالدهون واضحة بعد تسعة أيام من التحريض. علاوة على ذلك ، تم زيادة التعبير عن الجينات الشحمية المحددة Ppar-gamma-1 و Cebpa.

أظهرت العينات تلطيخا إيجابيا للأزرق الألسي أثناء الملاحظة المجهرية للتمايز الغضروفي. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر التلوين المناعي بالجسم المضاد للكولاجين من النوع الثاني تراكما محسنا لمصفوفة الغضاريف. يعد ضمان جدوى mBMSCs أمرا مهما للغاية في هذا البروتوكول.

يمكن تحقيق هذا الغرض عن طريق اختيار تجريبي مناسب ، والعمل على الجليد ، وتقصير الوقت التجريبي. باستخدام هذا النموذج في المختبر ، يمكن للمرء الحصول على عدد كبير من BMSCs التكاثرية للفك السفلي ، والتي قد تسهل دراسة الخصائص البيولوجية ، والتفاعل اللاحق على البيئة المكروية ، والتطبيقات الأخرى لعضلات الدم BMSC الفك السفلي.